一种仿病毒蛋白笼颗粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种仿病毒蛋白笼颗粒及其制备方法和应用。具体地，本发明专利技术提供一种基于纳米气泡的仿病毒蛋白笼颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：S1：制备体相纳米气泡溶液；S2：将病毒解组装成寡聚体，用组装缓冲液稀释寡聚体，纯化寡聚体，并确定寡聚体浓度；S3：向寡聚体中加入体相纳米气泡溶液并混匀，使仿病毒蛋白笼自组装发生，随后离心纯化，即得到自组装的仿病毒蛋白笼颗粒。所述仿病毒蛋白笼颗粒的制备方法具有以下优点：可调控性强，没有侵入性，制备条件温和，且自组装过程具有可逆性。性。性。

【技术实现步骤摘要】
一种仿病毒蛋白笼颗粒及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种基于纳米气泡的仿病毒蛋白笼颗粒的制备方法及由其制备的仿病毒蛋白笼颗粒及应用。

技术介绍

[0002]仿病毒蛋白笼颗粒简称蛋白纳米笼，是由一种或几种蛋白亚基自组装形成的形状、粒径高度均一的中空球状复合体。粒径在10-1000纳米之间，例如仿病毒纳米颗粒(virus-like nanoparticles)、胶囊蛋白(encapsulin)、铁蛋白(ferritin)、伴侣蛋白(chaperonin)等。这些蛋白笼结构具有分布广、种类多、生物相容性好、结构高度有序、单分散、组装解组装过程可人为调控等特点。常用的制备方法是通过带负电的外源物质诱导蛋白分子自组装的模板法和通过调节溶液pH实现蛋白笼亚基的组装和解组装的免模板法。
[0003]中空仿病毒蛋白纳米笼具有高负载性，在药物释放、水裂解、传感、催化等领域具有广泛的应用与研究价值。对球形中空仿病毒蛋白纳米笼进行表面功能化修饰，可以实现蛋白纳米笼的多种用途，如增强其靶向性。对于球形中空仿病毒蛋白笼的组装，模板法是最常用的方法。制备过程常以交联或者聚合的方式固定壳结构，经溶剂溶解除去模板后得到中空纳米球体，这种方法简单高效、纳米粒子的结构可调控性强，但制备的中空纳米球体通常缺乏规整的表面纳米结构。另外一种是免模板法。免模板法通常依靠目标材料的自组装实现，无需额外的模板，是组装空心结构最简单、方便的方法。在常规的组装过程中，蛋白分子必须在极端的pH条件下进行解组装，并在另一极端pH条件下重新实现自组装。例如，豇豆褪绿斑驳病毒蛋白在pH＝7.5的情况下，蛋白亚基发生解组装，而当溶液pH值降低到4.8及以下时，解聚的亚基才可以重新自组装恢复成笼状结构。这一pH值跳跃的过程仅部分可逆，进而导致蛋白分子重组可能不完全。极端的组装条件给后续功能化修饰带来挑战或直接导致功能化修饰失败。由于功能化修饰成功与否对后续传感、递送、治疗等应用的靶向性至关重要。因此，亟需研发一种无需外源物质、且在中性pH条件下就可以同时实现病毒蛋白的解组装与重组的方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的技术目的是提供一种基于纳米气泡的仿病毒蛋白笼颗粒的制备方法，所述方法无需外源物质即可制备仿病毒蛋白笼颗粒。
[0005]本专利技术的另一技术目的是提供由上述方法制备的仿病毒蛋白笼颗粒。
[0006]本专利技术的再一技术目的是提供所述仿病毒蛋白笼颗粒的用途。
[0007]一方面，本专利技术提供一种基于纳米气泡的仿病毒蛋白笼颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0008]S1：制备体相纳米气泡溶液；
[0009]S2：将病毒解组装成寡聚体，用组装缓冲液稀释寡聚体，纯化寡聚体，并确定寡聚体浓度；
[0010]S3：向寡聚体中加入体相纳米气泡溶液并混匀，使仿病毒蛋白笼自组装发生，随后离心纯化，即得到自组装的仿病毒蛋白笼颗粒。
[0011]在具体实施方式中，所述步骤S1包括以下步骤：
[0012]S11：利用电解水的方法制备体相纳米气泡溶液，制备的体相纳米气泡溶液为包含氢气纳米气泡和氧气纳米气泡的混合溶液；以及
[0013]S12：用0.45μm的过滤膜过滤后，备用。
[0014]在具体实施方式中，在步骤S11中制备的纳米气泡溶液的氧气的过饱和率为110％-130％，纳米气泡在溶液中的浓度为10
7-108个/mL，纳米气泡的zeta电位为小于等于-15mV。
[0015]在具体实施方式中，在步骤S2中，所述组装缓冲液为pH为7.5的Tris缓冲液，所述病毒可选自豇豆花叶病毒、烟草花叶病病毒，所述寡聚体浓度为1～5mg/mL，优选3mg/mL。
[0016]在具体实施方式中，所述步骤S3包括：
[0017]S31：向经过纯化的蛋白悬液，加入两倍体积的纳米气泡溶液。混合溶液先机械摇晃1min，然后置于恒温摇床上过夜，诱导衣壳蛋白自组装形成仿病毒蛋白笼，离心过滤以便对形成的仿病毒蛋白笼浓缩收集。
[0018]在具体实施方式中，在所述步骤S3中，在产物制备之后，进一步包括通过动态光散射(DLS)、透射电子显微镜(TEM)或原子力显微镜(AFM)对产物进行表征。
[0019]在具体实施方式中，在所述步骤S2和S3中，所述寡聚体纯化及仿病毒蛋白笼颗粒自组装过程均可在4℃环境下进行。
[0020]另一方面，本专利技术提供根据上述方法制备的仿病毒蛋白笼颗粒。
[0021]再一方面，本专利技术提供所述仿病毒蛋白笼颗粒在制备用于生物传感、药物靶向递送、疾病治疗的试剂中的用途。
[0022]有益效果
[0023]本专利技术具有以下有益效果：
[0024]1、本专利技术利用病毒蛋白的解组装与重组装的可控性，尤其是体相纳米气泡溶液的气体过饱和率、纳米气泡表面zeta电位和寡聚体临界组装浓度，可以通过增加气体过饱和率、增强气泡表面电势和提高寡聚体蛋白浓度来灵活控制仿病毒蛋白笼的组装，可调控性强。
[0025]2、本专利技术通过纳米气泡来诱导蛋白自组装制备仿病毒蛋白笼。与传统的外源模板物质驱动制备法相比，纳米气泡没有侵入性，且纳米气泡可以随时间自然消散，但仍然可以成功诱导蛋白自组装制备中空的仿病毒蛋白笼。同时本专利技术适用于不同种类(例如豇豆花叶病毒、烟草花叶病病毒)的病毒蛋白笼。
[0026]3、针对球形中空蛋白笼的制备，相比于利用环境pH改变诱导寡聚体自组装的方法，纳米气泡驱动寡聚体自组装的方法，在中性pH下进行，条件温和，从而保证蛋白笼表面功能化修饰的稳定性和活性，进一步提高蛋白笼后续传感、治疗等应用的靶向性。
[0027]4、本专利技术利用纳米气泡驱动蛋白自组装制备仿病毒蛋白笼具有可逆性，因时间过长或者外部环境因素导致的蛋白笼解组装，可以重新加入纳米气泡溶液，实现半破损状蛋白笼的重组装。
[0028]综上，纳米气泡是直径在1μm以下的气泡，已被证实可以在固液界面和体相中稳定
存在。本专利技术人在长期实践过程中发现：体相纳米气泡本身具有带负电的属性，且不受盐浓度影响。利用纳米气泡，可以驱动植物病毒蛋白自组装，生成仿病毒蛋白笼。
附图说明
[0029]图1示出利用本专利技术的方法制备的仿病毒蛋白笼颗粒的动态光散射(DLS)测试结果，(a)：纳米气泡+寡聚体的DLS测试结果，(b)：未电解的NaCl盐溶液+寡聚体的DLS测试结果。
[0030]图2示出利用本专利技术的方法制备的仿病毒蛋白笼颗粒的原子力显微镜(AFM)测试结果(A)及前述A图中直线标记处，对所形成的仿病毒纳米颗粒的高度(粒径)的分析结果(B)。
[0031]图3示出利用本专利技术的方法制备的仿病毒蛋白笼颗粒的透射电子显微镜(TEM)测试结果。
[0032]图4示出利用具有不同zeta电位(-13mV以及-20mV)的纳米气泡溶液，制备仿病毒蛋白笼颗粒的DLS测试情况。
[0033]图5示出在不同寡聚体浓度(1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米气泡的仿病毒蛋白笼颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：S1：制备体相纳米气泡溶液；S2：将病毒解组装成寡聚体，用组装缓冲液稀释寡聚体，纯化寡聚体，并确定寡聚体浓度；S3：向寡聚体中加入所述体相纳米气泡溶液并混匀，使仿病毒蛋白笼自组装发生，随后离心纯化，即得到自组装的仿病毒蛋白笼颗粒。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤S1包括以下步骤：S11：利用电解水的方法制备体相纳米气泡溶液，制备的体相纳米气泡溶液为包含氢气纳米气泡和氧气纳米气泡的混合溶液；以及S12：用0.45μm的过滤膜过滤后，备用。3.根据权利要求2所述的方法，其中，在步骤S11中制备的体相纳米气泡溶液的氧气过饱和率为110％-130％，纳米气泡在溶液中的浓度为10
7-108个/mL，纳米气泡的zeta电位为小于等于-15mV。4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤S2中，所述组装缓冲液为pH为7.5的Tris...

【专利技术属性】
技术研发人员：张敏敏，水玲玲，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：