7α-羟基类固醇脱氢酶突变体J-1-1制造技术

本发明专利技术涉及羟基类固醇脱氢酶，具体涉及7α

【技术实现步骤摘要】
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α-羟基类固醇脱氢酶突变体J-1-1
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C6及其应用


[0001]本专利技术涉及羟基类固醇脱氢酶，具体涉及7α-羟基类固醇脱氢酶(J-1-1)的突变体J-1-1
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C6及其在以复杂底物鸡胆粉为原料催化制备TUDCA中的应用。

技术介绍

[0002]羰基的不对称还原一直是化学反应研究的热点之一。虽然目前化学方法已经取得了一定 的成果，但是化学方法往往存在催化剂种类和数目有限、立体选择性不高、辅助试剂昂贵且 不易回收等缺点。而酶促反应不仅具有高效性、化学选择性、区域选择性，还具有高度的立 体选择性。羟基类固醇脱氢酶(Hydroxysteroid dehydrogenase，HSDH)介导的酶促反应具有 相对严格的立体选择性和“不”严格的底物特异性。早有文献指出7α-HSDHs能够催化胆酸 (CA)或鹅去氧胆酸(CDCA)及其牛磺酸或甘氨酸缀合物——牛磺胆酸(TCA)，牛磺鹅 去氧胆酸(TCDCA)，甘氨胆酸(GCA)和甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)C-7位的α-位羟基脱 羟基反应形成酮基。
[0003]HSDH的底物不仅仅局限在甾体类化合物，文献报道HSDH还可以催化烷基取代单环酮 类、二环酮类等物质的羰基不对称还原。HSDH所具有的优秀催化品质决定了其在生物转化 领域具有较大的应用潜力。近年来，科研人员逐渐认识到了7α-HSDH、7β-HSDH在生物转化 领域所具有的巨大应用潜力。目前，GenBank序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) 中登记的功能已经确认的7α-HSDH共有8个，它们分别来自于Bacteroides fragilis、Clostridiumscindens、Clostridium sordellii、Clostridium absonum、Stenotrophomonas maltophilia、Eubacteriumsp.VPI 12708、Clostridium difficile和Escherichia coli；来自C.absonum，Collinsella aerofacien， Ruminococcus gnavus和R.torques的7β-HSDH基因也已经成功被克隆。
[0004]有文献指出，选择鸡胆粉这类复杂基质作为生物合成TUDCA的底物，因为鸡胆粉主要 以TCDCA为主，且鸡胆粉来源广泛可以入药，将废弃的鸡胆粉作为培育熊胆粉的底物，变 废为宝，提高资源利用度。鸡胆粉中TCDCA的含量为42.58％，但是TCA含量占4.743％， 生物催化合成后的产物中出现TUCA，影响产品的纯度，增加了后期产品纯化分离的困难。 此外，TUCA游离型UCA是一种天然的胆酸，在体内肠道厌氧菌作用下转化生成次级胆汁酸 脱氧胆酸DCA，DCA是一种肿瘤刺激因子，通过激活信号传导通路促进大肠癌上皮细胞的 侵袭和生长，可以诱导大肠癌的发生。同时卫生部规定人工熊胆粉中TUDCA的含量不低于23％。因此，有必要挖掘具有底物选择性的7α-HSDHs或者通过分子改造技术使7α-HSDHs 具有底物选择性，从而高效合成TUDCA，使其更好的应用于工业化生产中。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种专一性催化CDCA及其缀合物的酶，该酶具有底物选择性， 可识别特定底物(CDCA、TCDCA、GCDCA)，在以复杂底物鸡胆粉为原料催化制备TUDCA 中具有巨大的应用价值。
H；当底物为CA或CDCA时，化学结构式中的R为当底物为GCDCA或GCA时，化学结构式中的R为当底物为TCDCA或TCA时，化学结构式中的R为
[0019]图2.7α-羟基类固醇脱氢酶(J-1-1)突变体J-1-1
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C6的SDS-PAGE电泳图；其中，M 为蛋白质分子量标准(Marker)，从上到下分子量大小依次是120，85，50，35，25，20kDa； J-1-1
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C6表示突变体酶蛋白，分子量大小为27.58kDa。
[0020]图3.7α-羟基类固醇脱氢酶(J-1-1)野生型的SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白质分 子量标准(Marker)，从上到下分子量大小依次是120，85，50，35，25，20kDa；J-1-1表示 野生型酶蛋白，分子量大小为28.25kDa。
[0021]图4.NADPH的标准曲线；其中，横坐标为NADPH溶液的浓度(mM)，纵坐标为NADPH 溶液在340nm处的光吸收值。
[0022]图5.野生型7α-HSDH J-1-1及其突变体的酶活测定结果；分别以CDCA、TCDCA、 GCDCA、CA、TCA和GCA为底物，其中J-1-1为野生型(灰柱)，J-1-1
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C6为突变体(黑 柱)。
[0023]图6.TCDCA和TUDCA的标准曲线；横坐标为进样量m(μg)的对数值lg(m)，纵坐标为 峰面积A的对数值lg(A)。
[0024]图7.7α-羟基类固醇脱氢酶(J-1-1)及其突变体J-1-1
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C6催化转化鸡胆粉的HPLC-ELSD 检测结果。(A)TUCA，TUDCA，T-7-KLCA，TCA和TCDCA标准品图谱；(B)以J-1-1 为催化剂催化转化鸡胆粉合成TUDCA的检测结果；(C)以J-1-1
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C6为催化剂选择性催化 转化鸡胆粉合成TUDCA的检测结果。横坐标为保留时间min，纵坐标为电信号mV。
具体实施方式
[0025]下面结合具体实施例进一步描述本专利技术，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明， 不以任何方式限制本专利技术的范围。
[0026]主要试剂
[0027]Prime STAR Max Premix(2
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)，宝生物科技有限公司(大连)，货号：R045A；BamH I， 宝生物科技有限公司(大连)，货号：1010S；Xho I，宝生物科技有限公司(大连)，货号： 1094S；T4 DNA Ligase，宝生物科技有限公司(大连)，货号：2011A；pGEX-6p-2质粒为已 知载体，购买自上海生工生物科技有限公司；Trans5α感受态细胞，全式金生物技术有限公司， 货号：CD201-01；E.coli BL21(DE3)感受态细胞，全式金生物技术有限公司，货号：CD601； 磷酸盐缓冲液(PBS)干粉，北京索莱宝科技有限公司，货号：P1010；Glutathione Sepharose 4B，购买自GE Healthcare，货号：10223836；PreScission Protease酶，购买自GenScript公司， 货号：Z02799-100；Bradford蛋白浓度测定试剂盒，购买自Beyotime公司，货号：P0006； 回收试剂盒Cycle Pure Kit，OMEGA BIO-TEK(中国代理商)，货号：D6493；质 粒提取试剂盒Plasmid Mi本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的C-端截短6个氨基酸所得。2.编码权利要求1所述的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。4.包含权利要求2或3所述基因的表达盒、载体或重组菌。5.权利要求1所述的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：合成所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因，构建表达载体，转化蛋白表达宿主菌，诱导蛋白表达并纯化。6.根据权利要求5所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘银平，王伯初，祝连彩，唐士金，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：