一种提高dcaps标记检测效率的方法技术

本发明专利技术提供一种提高dcaps标记检测效率的方法，涉及分子生物学技术领域。该提高dcaps标记检测效率的方法，包括以下步骤：S1、选取目的基因序列：提取已知小麦抗叶锈基因Lr67和其野生型病感基因，S2、dCAPS引物设计：提取S1中小麦抗叶锈基因Lr67配合dCAPS Finder2.0设备制备正常序列长度引物，S3、引物序列长度扩增：将S2中制备引物进行一定序列长度扩增。该提高dcaps标记检测效率的方法，在dCAPS在引物中引入酶切位点，引物的长度一般为20bp左右，因此PCR酶切后产生比原来短20bp左右片段，要区分20bp的片段差异一般需采用聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离，本发明专利技术在引物5

【技术实现步骤摘要】
一种提高dcaps标记检测效率的方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，特别的为一种提高dcaps标记检测效率的方法。

技术介绍

[0002]单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNP）是分布最广，数量最多的遗传标记，当SNP位点恰好位于限制性酶切位点时可以利用酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，CAPS）技术来检测，但是这种情况比较少，（Derived Cleaved Amplified Polymorphic Sequences，dCAPS）技术是CAPS的扩展，通过在SNP附近设计引物时引入错配碱基，从而产生或者去除限制性内切酶识别位点进行检测，通过CAPS和dCAPS技术可以检测几乎所有的SNP位点，但是现有技术中，在dCASP技术引入的错配碱基在引物序列中，即酶切位点在引物末端附近，一般的引物长度为20bp左右，所以酶切产物的片段大小差异一般为20bp左右，这样的差异利用琼脂糖电泳来分离非常困难，若采用分辨率高的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，则需要花费更多的时间和精力用于复杂的凝胶制备和染色，因此，dCAPS检测效率在实际应用中受到限制，使实际标记检测效率较低。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供的专利技术目的在于提供一种提高dcaps标记检测效率的方法，能够有效简化实际检测流程，缩短实际电泳时间，便于进行目标基因的的染色，进而有效提高实际检测效率。
[0004]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种提高dcaps标记检测效率的方法，包括有以下步骤：S1、选取目的基因序列：提取已知小麦抗叶锈基因Lr67和其野生型病感基因。
[0005]S2、dCAPS引物设计：提取S1中小麦抗叶锈基因Lr67配合dCAPS Finder2.0设备制备正常序列长度引物。
[0006]S3、引物序列长度扩增：将S2中制备引物进行一定序列长度扩增。
[0007]S4、PCR扩增小麦抗叶锈基因Lr67：使用PCR扩增设备使S3中引物正常进行小麦抗叶锈基因Lr67的PCR扩增。
[0008]S5、琼脂糖凝胶预备：向每100mlTAE电泳缓冲液中添加1g琼脂糖，混合摇匀混合溶液，将混合均匀后溶液放置于加热设备中加热至琼脂糖完全溶解后取出，待混合溶液冷却至60℃后加入EB染液摇匀。
[0009]S6、电泳条件预备：将S4中混合溶液注入用胶带密封两端后的胶板中，并选取适当规格梳子插入胶板内部，室温状态下等待混合溶液凝固，再取下混合溶液凝固后胶板两端胶带，将凝固后混合溶液放置于电泳槽内部，并向电泳槽内部添加TAE电泳缓冲液，之后垂直方向拔出梳子。
[0010]S7、标记基因、检测：用移液器吸取S1中野生型病感基因和S4中小麦抗叶锈基因Lr67于封口膜上，再加入载样缓冲液，将混合后的溶液混匀后注入点样孔，启动电泳槽，取
出电泳处理后的固态混合溶液，并将固态混合溶液置于EB染液中进行染色处理，将染色处理后的固态混合溶液用清水适当漂洗后置于紫外投射检测仪上进行标记效果比对观察。
[0011]作为本专利技术进一步的方案：所述序列长度扩增即通过在小麦抗叶锈基因Lr67序列中引入Hinfl酶切位点的引物，同时将引入的Hinfl酶切位点引物的5
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端添加30bp-40 bp的多聚嘌呤或多聚嘧啶制得增长序列长度后的引物。
[0012]作为本专利技术进一步的方案：所述多聚嘌呤和多聚嘧啶为多聚腺嘌呤与多聚胸腺嘧啶中的任意一种或多种。
[0013]作为本专利技术进一步的方案：所述琼脂糖含量为2%，所述EB染液用量为100μl，且EB染液浓度为0.5mg/ml。
[0014]作为本专利技术进一步的方案：所述TAE电泳缓冲液液面覆盖固态混合溶液高度为1-2mm。
[0015]作为本专利技术进一步的方案：所述注入胶板中混合溶液温度为45℃-50℃。
[0016]作为本专利技术进一步的方案：所述野生型病感基因和小麦抗叶锈基因Lr67用量均为4μl。
[0017]作为本专利技术进一步的方案：所述载样缓冲液为正常浓度的6倍，且载样缓冲液用量为2μl。
[0018]作为本专利技术进一步的方案：所述电泳槽启动持续时间为30-60min，启动电压为3-5V。
[0019]作为本专利技术进一步的方案：所述EB染液染色时间5-10min。
[0020]本专利技术提供了一种提高dcaps标记检测效率的方法。具备以下有益效果：该提高dcaps标记检测效率的方法，在dCAPS在引物中引入酶切位点，引物的长度一般为20bp左右，因此PCR酶切后产生比原来短20bp左右片段，要区分20bp的片段差异一般需采用聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离，本专利技术在引物5
’
端加上30bp以上的尾巴序列，使酶切后野生型和突变体的片段大小差异增加到50bp以上，进而可以用2%的琼脂糖凝胶电泳简便快速的分离，本专利技术使dCAPS检测可以用琼脂糖凝胶电泳替代聚丙烯酰胺凝胶电泳，由于聚丙烯酰胺凝胶存在制备复杂，电泳时间长，染色复杂等缺点，因此本专利技术简化了dCAPS检测方式，降低了检测时间，提高了dCAPS检测效率。
附图说明
[0021]图1为本专利技术的流程图；
具体实施方式
[0022]以下参照具体的实施例来说明本专利技术。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，其不以任何方式限制本专利技术的范围。
[0023]实施例1、一种提高dcaps标记检测效率的方法，包括以下步骤：步骤一、选取目的基因序列：提取已知小麦抗叶锈基因Lr67和其野生型病感基因，提供实验所需基本原料，步骤二、dCAPS引物设计：提取步骤一中小麦抗叶锈基因Lr67配合dCAPS Finder2.0设备制备正常序列长度引物，准备实验所需原料，步骤三、引物序列长度扩增：将步骤二中制备引物进行一定序列长度扩增，序列长度扩增即通过在小麦抗叶锈基因Lr67序列中引入Hinfl酶
切位点的引物，同时将引入的Hinfl酶切位点引物的5
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端添加30bp以上的多聚嘌呤或多聚嘧啶制得增长序列长度后的引物，多聚嘌呤和多聚嘧啶为多聚腺嘌呤与多聚胸腺嘧啶中的任意一种或多种，增长引物整体序列，使PCR扩增能够有效扩增出较长的有效目的基因序列，步骤四、PCR扩增小麦抗叶锈基因Lr67：使用PCR扩增设备使步骤三中引物正常进行小麦抗叶锈基因Lr67的PCR扩增，制备检测原料，步骤五、琼脂糖凝胶预备：向每100mlTAE电泳缓冲液中添加1g琼脂糖，混合摇匀混合溶液，将混合均匀后溶液放置于加热设备中加热至琼脂糖完全溶解后取出，待混合溶液冷却至60℃后加入EB染液摇匀，琼脂糖含量为2%，EB染液用量为100μl，且EB染液浓度为0.5mg/ml，准备通过琼脂糖凝胶电泳进行标记基因的有效检测，步骤六、电泳条件预备：将步骤四中混合溶液注入用胶带密封两端后的胶板中，并选取适当规格梳子插入胶板本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高dcaps标记检测效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、选取目的基因序列：提取已知小麦抗叶锈基因Lr67和其野生型病感基因；S2、dCAPS引物设计：提取S1中小麦抗叶锈基因Lr67配合dCAPS Finder2.0设备制备正常序列长度引物；S3、引物序列长度扩增：将S2中制备引物进行一定序列长度扩增；S4、PCR扩增小麦抗叶锈基因Lr67：使用PCR扩增设备使S3中引物正常进行小麦抗叶锈基因Lr67的PCR扩增；S5、琼脂糖凝胶预备：向每100mlTAE电泳缓冲液中添加1g琼脂糖，混合摇匀混合溶液，将混合均匀后溶液放置于加热设备中加热至琼脂糖完全溶解后取出，待混合溶液冷却至60℃后加入EB染液摇匀；S6、电泳条件预备：将S4中混合溶液注入用胶带密封两端后的胶板中，并选取适当规格梳子插入胶板内部，室温状态下等待混合溶液凝固，再取下混合溶液凝固后胶板两端胶带，将凝固后混合溶液放置于电泳槽内部，并向电泳槽内部添加TAE电泳缓冲液，之后垂直方向拔出梳子；S7、标记基因、检测：用移液器吸取S1中野生型病感基因和S4中小麦抗叶锈基因Lr67于封口膜上，再加入载样缓冲液，将混合后的溶液混匀后注入点样孔，启动电泳槽，取出电泳处理后的固态混合溶液，并将固态混合溶液置于EB染液中进行染色处理，将染色处理后的固态混合溶液用清水适当漂洗后置于紫外投射检测仪上进行标记效果比对观察。2.根据权利要求1所述的一种提高dcaps标记检测效率的方法，其特征在于，根据S3中操作步骤，所述序列长度扩增即通过在小麦抗叶锈基因Lr67序列中引入Hinfl酶切位点的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玮，宋国琦，李根英，李玉莲，张淑娟，张荣志，李吉虎，高洁，
申请(专利权)人：山东省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：