玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种冬虫夏草寄主昆虫玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法及检测试剂盒，根据玉树无钩蝠蛾的mtDNA中部分基因的序列设计特异性引物YSF3/YSR3和探针YS

【技术实现步骤摘要】
玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法及检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及中药材和植物检疫
，具体涉及一种玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法；此外，本专利技术还涉及用于实时荧光PCR检测玉树无钩蝠蛾的试剂盒。

技术介绍

[0002]玉树无钩蝠蛾Ahamus yushuensis（Chu et Wang，1985），隶属于鳞翅目（Lepidoptera）蝙蝠蛾科（Hepialidae）无钩蝠蛾属（Ahamus），是冬虫夏草寄主昆虫，冬虫夏草是我国传统的名贵中药材，被收录入我国药典，被称为“中药三宝”之一，在我国仅在青藏高原的西藏、青海、四川、云南、甘肃五省部分地区有分布。同时，冬虫夏草寄主昆虫具有明显的种类地域分布特征，通常一个产区的冬虫夏草寄主昆虫为一种昆虫，仅有少数优势种类在多个冬虫夏草产区有分布。在中药材领域，不同地区的冬虫夏草品级相差较大，玉树无钩蝠蛾是冬虫夏草寄主昆虫的优势种，真菌寄生在玉树无钩蝠蛾上而产的冬虫夏草质量较好，该虫在四川甘孜州康定县、青海玉树州有分布。因此，区分冬虫夏草的寄主昆虫，能有效的区分冬虫夏草的品级，因此建立不同寄主昆虫冬虫夏草的快速准确鉴定方法十分必要。
[0003]中国专利技术专利申请CN201210506713公开了一种冬虫夏草原草粉的双重PCR鉴真方法，其运用冬虫夏草菌和冬虫夏草寄主昆虫通用引物进行双重PCR扩增的鉴别冬虫夏草原粉，与本专利申请目标和方法不同，无法进行冬虫夏草寄主昆虫检测。
[0004]中国专利技术专利申请CN201711340871公开了冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的检测引物组、检测试剂盒和检测方法，其通过常规PCR反应检测冬虫夏草菌培养液中蝙蝠蛾拟青霉的携带情况的方法，用于检测冬虫夏草菌培养液，与本专利申请目标和方法不同。
[0005]中国专利技术专利申请CN201210034612公开了一种鉴别冬虫夏草的线粒体基因序列和方法，通过设计冬虫夏草寄主昆虫蝙蝠蛾科特异性引物以区别冬虫夏草寄主昆虫蝙蝠蛾科与其它鳞翅目昆虫，用于鉴别冬虫夏草真伪，根据最新冬虫夏草寄主昆虫研究进展，冬虫夏草寄主昆虫分类地位变化，冬虫夏草寄主昆虫主要集中在蝙蝠蛾科现钩蝠蛾属( Thitarodes)、无钩蝠蛾属( Ahamus) 和蝠蛾属( Hepialus)(邹志文等,2010;邱乙等,2015)。该专利中将是否为蝙蝠蛾科昆虫作为鉴定冬虫夏草真伪的标准已不符合实际情况。另外，其目标与方法与本专利申请不同。
[0006]中国专利技术专利申请CN201910910660公开了荧光定量PCR检测粉拟青霉菌的引物和探针，其针对人工培育冬虫夏草夏草过程中出现的寄主昆虫致死菌-粉拟青霉菌的实时荧光检测方法，检测目标与本专利申请检测目标不同。
[0007]中国专利技术专利申请CN202010148471.2公开了小金蝠蛾的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针，其检测目标与本专利申请检测目标不同。小金蝠蛾分布局限，研究深入，其线粒体全序列在NCBI上已有发布，可在线粒体基因全序列基础上设计其引物探针。而玉树无钩蝠蛾同为冬虫夏草优势寄主昆虫，但是其近似种较多，其线粒体基因全序列尚不明确，这给研究玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法带来了更大的技术困难。
[0008]目前没有冬虫夏草寄主昆虫玉树无钩蝠蛾的实时荧光鉴定相关的专利文献和非
专利文献公开。
[0009]本专利技术针对名贵中药冬虫夏草的寄主昆虫进行鉴定区分。中药材冬虫夏草为冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科Hepialidae昆虫幼虫上以后形成的僵虫和菌子实体的干燥体，无法在形态上区分冬虫夏草的寄主昆虫，且冬虫夏草寄主昆虫种类繁多，地理分布较近的种类分子水平的差异也较小，这对实时荧光特异性Taqman探针的设计造成一定难度，是本领域的技术难题。因此，本领域亟需解决这一技术难题。

技术实现思路

[0010]本专利技术要解决的技术问题是提供一种玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法，解决冬虫夏草寄主昆虫基因序列差异较小，玉树无钩蝠蛾特异片段定位困难，容易出现假阳性扩增的技术难题，以达到快速准确检测鉴定玉树无钩蝠蛾的目的；为此，本专利技术还提供用于上述方法的检测试剂盒。利用玉树无钩蝠蛾检测引物及探针可以快速、准确地对寄主昆虫为玉树无钩蝠蛾冬虫夏草进行检测鉴定。
[0011]本专利技术测定了玉树无钩蝠蛾线粒体基因mtDNA全序列，根据玉树无钩蝠蛾的mtDNA中位于nad6基因上的特异靶标序列设计特异性引物和探针，建立了玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR 检测方法，以达到快速准确检测鉴定玉树无钩蝠蛾的目的。
[0012]在本专利技术的一方面，提供一种玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：(1) 设计引物和探针；该引物的序列为：上游引物YSF3：5
’-ꢀ
GTTGCAAGAATTGCATCAAATG
ꢀ-3’ꢀ
，如SEQ ID NO：7所示序列；下游引物YSR3：5
’-ꢀ
AGATCGTAAAGGCCCATAATTG
ꢀ-3’
，如SEQ ID NO：8所示序列；所述探针如下：玉树无钩蝠蛾探针YS-P3：5
’-ꢀ
AAATTTATAATAGCCAAAGCTATT
ꢀ-3’ꢀ
，如SEQ ID NO：9所示序列，荧光基团连接在探针的5
’
末端，淬灭基团连接在3
’
末端。
[0013](2) 提取玉树无钩蝠蛾DNA；(3) 采用步骤（1）设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测，用以区分玉树无钩蝠蛾和其它冬虫夏草寄主昆虫。
[0014]作为本专利技术优选的技术方案，步骤（2）具体为：取玉树无钩蝠蛾虫及虫草样放入研钵，加液氮磨成粉末状，用试剂盒提取样品DNA。
[0015]作为本专利技术优选的技术方案，步骤（3）中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为25μL，包括2
×
Premix Ex Taq12.5μL，50
×
ROX Reference Dye0.5μL，步骤（1）设计的上下游引物YSF3和YSR3各1.0μL，浓度为5μmol/L，YS-P3探针1.0μL，浓度为5μmol/L，DNA模板2.0μL，超纯水补至25μL。
[0016]作为本专利技术优选的技术方案，步骤（3）中，所述实时荧光PCR检测的反应程序为：预变性95℃ 10min；然后95℃ 15sec，60℃ 30sec 循环40 次。
[0017]上述实时荧光PCR检测方法采用TaqMan探针。TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5
’
末端，而淬灭剂则在3
’
末端。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；
PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1) 设计引物和探针；该引物的序列为：上游引物YSF3为如SEQ ID NO：7 所示序列：5
’-ꢀ
GTTGCAAGAATTGCATCAAATG
ꢀ-3’
；下游引物YSR3为如SEQ ID NO：8 所示序列：5
’-ꢀ
AGATCGTAAAGGCCCATAATTG
ꢀ-3’
；该探针的序列为：玉树无钩蝠蛾探针YS-P3为如SEQ ID NO：9 所示序列：5
’-ꢀ
AAATTTATAATAGCCAAAGCTATT
ꢀ-3’ꢀ
，荧光基团连接在探针的5
’
末端，淬灭基团连接在3
’
末端；(2) 提取玉树无钩蝠蛾DNA；(3) 采用步骤（1）设计的引物和探针进行实时荧光PCR检测，用以区分玉树无钩蝠蛾和其它冬虫夏草寄主昆虫。2.如权利要求1所述的玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤（2）具体为：取玉树无钩蝠蛾虫及虫草样放入研钵，加液氮磨成粉末状，用试剂盒提取样品DNA。3.如权利要求1所述的玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述实时荧光PCR检测的反应体系为25μL，包括2
×
Premix Ex Taq12.5μL，50
×
ROX Reference Dye0.5μL，步骤（1）设计的上下游引物YSF3和YSR3各1.0μL，浓度为5μmol/L，YS-P3探针1.0μL，浓度为5μmol/L，DNA模板2.0μL，超纯水补至25μL。4.如权利要求1或3所述的玉树无钩蝠蛾的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，步骤（...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘静远，印丽萍，张宁，易建平，
申请(专利权)人：上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：