生物催化产生萜烯化合物的方法技术

本文提供了通过应用新型的磷酸酶来产生萜烯化合物的生物催化方法。该方法允许完全生化合成萜烯化合物，例如柯巴醇和赖百当烯二醇，以及它们的衍生物，它们用作产生香料成分例如降龙涎香醚的有价值的中间体。还提供了用于产生此类化合物的新颖的完全生化多步骤方法，以及新颖的磷酸酶以及由其衍生的突变体和变体。变体。变体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物催化产生萜烯化合物的方法


[0001]本文提供了通过应用新型的磷酸酶来产生萜烯化合物的生物催化方法。该方法允许完全生化合成萜烯化合物，例如柯巴醇(copalol)和赖百当烯二醇(labdendiol)，以及它们的衍生物，它们用作产生香料成分例如降龙涎香醚(ambrox)或γ-ambrol的有价值的中间体。还提供了用于产生此类化合物的新颖的完全生化多步骤方法，以及新颖的磷酸酶以及由其衍生的突变体和变体。

技术介绍

[0002]萜烯存在于大多数生物(微生物、动物和植物)中。这些化合物由称为异戊二烯单元的五碳单元构成并且通过存在于它们结构中的这些单元的数目进行分类。因此，单萜、倍半萜和二萜是分别含有10、15和20个碳原子的萜烯。例如，在植物界中广泛地存在有倍半萜。许多倍半萜分子因为它们的风味和芳香特性以及它们的美容、医疗和抗菌效果而众所周知。已经鉴定出许多倍半萜烃和倍半萜类化合物。
[0003]萜烯的生物合成产生涉及称为萜合酶的酶。这些酶将无环萜烯前体转化成一种或多种萜烯产物。具体而言，二萜合酶通过前体香叶基香叶基二磷酸(GGPP)的环化产生二萜。GGPP的环化通常需要两种酶多肽，即在两个连续的酶促反应中组合起作用的I型和II型二萜合酶。II型二萜合酶催化由GGPP的末端双键质子化引发的GGPP的环化/重排，导致环状二萜二磷酸中间体。然后该中间体被催化电离引发的环化的I型二萜合酶进一步转化。
[0004]二萜合酶存在于植物和其他生物中，并使用底物如GGPP，但它们具有不同的产物特征。编码二萜合酶的基因和cDNA已经被克隆，并且表征了相应的重组酶。
[0005]到目前为止，还没有描述过从萜烯二磷酸中间体，特别是从环状萜烯二磷酸中间体，例如二萜柯巴基二磷酸(酯)(CPP)或赖百当烯二醇二磷酸(酯)(LPP)，特异性或优先裂解或除去二磷酸酯基的酶。为了进行所述裂解，将需要磷酸酯键的化学裂解。
[0006]本专利技术要解决的问题是提供一种显示出磷酸酶的酶促活性的多肽，该磷酸酶可用于萜烯基二磷酸键的酶促裂解，并允许生物催化产生萜烯醇。

技术实现思路

[0007]上述问题可以出乎意料地通过提供一类新的酶来解决，该酶显示萜烯基二磷酸磷酸酶活性，其选自大蛋白质酪氨酸磷酸酶家族的二磷酸去除酶的亚组。现有技术中没有描述过蛋白质酪氨酸磷酸酶家族的这种酶作为磷酸酶的应用，其利用萜烯基二磷酸作为底物，特别是诸如CPP和LPP的这种复杂的双环化合物。
[0008]这种方法可以提供更具成本效益的产生萜烯中间体(例如柯巴醇和赖百当烯二醇)的方法，它们是制备高价值香料成分(例如Ambrox)的基础材料。
[0009]在本专利技术的一些实施方案中，还提供了从相应的二磷酸前体的生物催化产生非环状萜烯醇，例如法尼醇或香叶基香叶醇。
[0010]所述生物催化步骤可以与其他几个先前的或连续的酶促步骤偶联，并允许提供生
物催化的多步法，用于从它们各自的前体完全酶促合成有价值的复杂萜烯分子。
附图说明
[0011]图1.柯巴醇的生物合成途径。1，法呢基焦磷酸合酶。2，香叶基香叶基焦磷酸合酶。3，柯巴基焦磷酸合酶。4，磷酸酶。
[0012]图2a.大肠杆菌细胞产生的柯巴醇的GC-MS分析色谱图。上色谱图：大肠杆菌细胞，产生甲羟戊酸途径的重组酶，CPP合酶和AspWeTPP。中色谱图：大肠杆菌细胞，产生甲羟戊酸途径的重组酶，CPP合酶和TalVeTPP。下色谱图：用大肠杆菌细胞产生甲羟戊酸途径的重组酶和CPP合酶进行的对照。
[0013]图2b.大肠杆菌细胞产生的柯巴醇的质谱图(在图1a中保留时间为16.7的峰)(A)和真实的柯巴醇的质谱图(B)。
[0014]图3.使用TalVeTPP和AspWeTPP在工程化大肠杆菌细胞中产生柯巴醇。
[0015]图4.使用TalVeTPP，AspWeTPP，HelGriTPP1，UmbPiTPP1，TalVeTPP2，HydPiTPP1，TalCeTPP1，TalMaTPP1，TalAstroTPP1或PeSubTPP1在工程化大肠杆菌细胞中产生柯巴醇。
[0016]图5.赖百当烯二醇的生物合成途径。1，法呢基焦磷酸合酶。2，香叶基香叶基焦磷酸合酶。3，赖百当烯二醇焦磷酸合酶。4，磷酸酶。
[0017]图6.使用TalVeTPP，AspWeTPP，HelGriTPP1，UmbPiTPP1，TalVeTPP2，HydPiTPP1，TalCeTPP1，TalMaTPP1，TalAstroTPP1或PeSubTPP1在工程化大肠杆菌细胞中产生赖百当烯二醇。
[0018]图7a.大肠杆菌细胞产生的赖百当烯二醇的GC-MS分析色谱图。上色谱图：大肠杆菌细胞，产生甲羟戊酸途径的重组酶，LPP合酶和HelGriTPP1。下色谱图：用大肠杆菌产生甲羟戊酸途径的重组酶和LPP合酶进行的对照。
[0019]图7b.大肠杆菌细胞产生的赖百当烯二醇的质谱图(在图6a中保留时间为18.2的峰)(A)和真实的柯巴醇的质谱图(B)。
[0020]图8.法尼醇和香叶基香叶醇的生物合成途径。1，法呢基焦磷酸合酶。2，香叶基香叶基焦磷酸合酶。3，磷酸酶。
[0021]图9.使用TalVeTPP，AspWeTPP，HelGriTPP1，UmbPiTPP1，TalVeTPP2，HydPiTPP1，TalCeTPP1，TalMaTPP1，TalAstroTPP1或PeSubTPP1在工程化大肠杆菌细胞中产生法尼醇和香叶基香叶醇。
[0022]图10.使用TalVeTPP，AspWeTPP，HelGriTPP1，UmbPiTPP1，TalVeTPP2，HydPiTPP1，TalCeTPP1，TalMaTPP1，TalAstroTPP1或PeSubTPP1在工程化大肠杆菌细胞中产生法尼醇、香叶基香叶醇、柯巴醇和赖百当烯二醇的比较。值是相对于每种化合物的最大产量设置为100而言的。
[0023]图11.用质粒CPOL-2和LOH-2转化的工程化大肠杆菌细胞中萜烯化合物的产生，并与产生LPP和CPP而不表达重组磷酸酶的细胞进行比较。
[0024]图12.在工程化细胞中产生的柯巴醇。该图显示了大肠杆菌细胞产生的柯巴醇的GC-MS分析色谱图。这些细胞经过工程改造，可以从甲羟戊酸途径中产生柯巴基二磷酸(酯)，并表达蛋白质酪氨酸磷酸酶和ADH酶。每个色谱图均标明了细胞中表达的不同ADH。
[0025]图13.GCMS色谱图，显示了在经过工程改造以产生甲羟戊酸途径的重组酶，CPP合
酶，蛋白质酪氨酸磷酸酶和ADH的细胞中从法呢醇形成法呢醛。
[0026]图14.大肠杆菌细胞中的赖百当烯二醇氧化产物的产生的GCMS分析，该细胞经工程改造以产生甲羟戊酸途径的重组酶，LPP合酶，蛋白质酪氨酸磷酸酶和ADH。每个色谱图均标明了细胞中表达的不同ADH。赖百当烯二醇及其氧化产物的峰分别标记为1和2。
[0027本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种产生通式1的萜烯醇化合物的生物催化方法，其中R代表H或环状或非环状、直链或支链、饱和或不饱和的、可选有取代基的烃基残基，该方法包括以下步骤：(1)使所述式(1)的萜烯化合物的相应的萜烯基二磷酸前体与具有萜烯基二磷酸磷酸酶活性的多肽接触以形成所述萜烯醇；和(2)可选地，将步骤(1)的萜烯醇分离，其中所述具有萜烯基二磷酸磷酸酶活性的多肽选自蛋白质酪氨酸磷酸酶家族的二磷酸去除酶成员。2.一种产生双环二萜醇化合物的生物催化方法，包括以下步骤：a)使所述双环二萜化合物的相应双环二萜烯基二磷酸前体与具有萜烯基二磷酸磷酸酶活性的多肽接触以形成所述双环二萜醇；和b)可选地，将步骤(1)的双环二萜醇分离。3.权利要求2的方法，其中所述具有萜烯基二磷酸磷酸酶活性的多肽选自蛋白质酪氨酸磷酸酶家族的二磷酸去除酶成员。4.权利要求1或3的方法，其中所述具有萜烯基二磷酸磷酸酶活性的多肽选自一类二磷酸去除酶，该二磷酸去除酶的特征在于具有以下活性位点签名基序的氨基酸序列：HCxxGxxR(SEQ ID NO:57)其中每个x彼此独立地代表任何天然氨基酸残基。5.权利要求4的方法，其中所述活性位点签名基序是：HC(T/S)xGKDRTG(SEQ ID NO:58)其中x代表任何天然氨基酸残基。6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述具有萜烯基二磷酸磷酸酶活性的多肽从由以下多肽构成的群组中选出：a)TalVeTPP，其包含根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列b)AspWeTPP，其包含根据SEQ ID NO:6的氨基酸序列c)HelGriTPP，其包含根据SEQ ID NO:10的氨基酸序列，d)UmbPiTPP1，其包含根据SEQ ID NO:13的氨基酸序列e)TalVeTPP2，其包含根据SEQ ID NO:16的氨基酸序列f)HydPiTPP1，其包含根据SEQ ID NO:19的氨基酸序列，g)TalCeTPP1，其包含根据SEQ ID NO:22的氨基酸序列，
h)TalMaTPP1，其包含根据SEQ ID NO:25的氨基酸序列，i)TalAstroTPP1，其包含根据SEQ ID NO:28的氨基酸序列，和j)PeSubTPP1，其包含根据SEQ ID NO:31的氨基酸序列，和k)一种多肽，其具有萜烯基二磷酸磷酸酶活性并且包含与根据a)至j)的所述氨基酸序列中的至少一个显示出至少60％序列同一性的氨基酸序列。7.权利要求1和4至6中任一项的方法，其中制备了通式1的萜烯醇化合物，其中R代表H或非环状、直链或支链、饱和或不饱和的烃基残基。8.权利要求7的方法，其中式1的萜烯醇选自法尼醇和香叶基香叶醇。9.权利要求2至6中任一项的方法，其中步骤(1)还包括使非环状...

【专利技术属性】
技术研发人员：M，
申请(专利权)人：弗门尼舍有限公司，
类型：发明
国别省市：