杂交全LNA寡核苷酸制造技术

本报告涉及杂交完全由锁核酸(LNA)单体组成的单链(ss

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】杂交全LNA寡核苷酸
[0001]本报告涉及完全由锁核酸(LNA)单体组成的杂交单链(ss-)寡核苷酸。本文件示出用成对的完全互补ss-寡核苷酸进行的杂交实验，出乎意料地，所述完全互补ss-寡核苷酸未能在给定的时间间隔内形成双链体。本报告提供鉴定这种不相容的寡核苷酸对的有效方法。在另一方面，本报告提供成对的互补单链寡核苷酸，其完全由锁核酸(LNA)单体组成，出人意料地，其在没有事先变性的情况下能够快速地形成双链体。本报告还提供鉴定和选择这种相容的全LNA ss寡核苷酸对的方法。在另一方面，本报告提供相容的寡核苷酸对在生化测定(例如结合测定、免疫测定中)作为结合配偶体的用途。讨论了具体的实施例，其中将相容的LNA寡核苷酸对用于固定不同的靶分子，例如分析物特异性捕获分子，在测定中以检测或确定样品中的分析物。

技术介绍

[0002]特别关注的是一般生化应用，其中结合对的两个配偶体的特异性相互作用以及它们彼此之间最终的连接起功能性作用。在异相免疫测定中，生物素：(链霉)亲和素结合对非常频繁地用于将分析物特异性捕获受体固定在固定相上。本报告在其他应用中概念化、解释并证明了适用于免疫测定的替代结合对。具体地，由两个能够通过杂交形成双链体的单链全LNA寡核苷酸制成的替代结合对提供生物素的技术替代物：(链霉)亲和素结合对。
[0003]本公开的重点是在免疫测定过程中将捕获受体锚定在固定相上的手段。特别地，本公开集中于结合对，其在含有分析物的样品存在下促进捕获受体的固定化，和/或能够在复合物形成后锚定检测复合物。免疫测定中的结合对在技术上需要具有特异性特征。因此，两个结合配偶体的相互作用必须是特异性的。此外，连接形成的动力学，即结合对的两个分离的配偶体相互作用并最终缔合的速度，即彼此结合的速度期望高。另外，两个结合配偶体的连接一旦形成就期望是稳定的。此外，结合配偶体必须适合与其他分子(例如分析物特异性受体和固定相表面)化学缀合，以用于免疫测定。重要的是要认识到，在免疫测定中，受体和通常还有待检测的分析物仅在某些条件下才能保持其构象和功能，而这些条件可能会因具体考虑的特定受体或分析物而有所不同；因此，受体分子或分析物只能耐受这些条件的有限偏差。仅举几例，这样的条件可以包括(但不限于)在约pH 6至约pH 8的pH范围内的缓冲水溶液、一种或多种溶解盐、一种或多种辅助物质，总计约250mosm/kg至约400mosm/kg的溶质，在20℃至40℃的预选温度范围。
[0004]要求结合对的分离的配偶体适合于缀合，具体地是与捕获分子即受体的缀合，以及与固定相表面的缀合，而又不丧失它们与彼此特异性缔合和结合的能力。关于免疫测定中的缀合物，替代结合对的每个分离的结合配偶体必须在测定条件下起作用。相同的推理适用于与结合配偶体缀合的所有其他所需材料，例如但不限于测定过程中可能存在的分析物、载体材料、固定相和其他物质或化合物。
[0005]先前已经提出了用具有互补序列的单链寡核苷酸，即能够通过杂交形成双链体的寡核苷酸作结合对工具，来连接大分子或将分子连接至固定相。EP 0488152公开了一种使用固定相的异相免疫测定法，其通过连接抗体和固定相的核酸双链体将分析物特异性捕获
抗体固定在固定相上。一个实施例中示出了一个杂交的寡核苷酸附着于抗体，而互补的寡核苷酸附着于固定相，从而形成连接双链体。在文件EP 0698792、WO 1995/024649、WO 1998/029736和EP 0905517中提供了类似的公开内容。WO 2013/188756公开流式细胞术的方法和组合物，所述组合物包含抗体、寡球和寡核苷酸探针，所述抗体缀合至第一寡核苷酸，所述寡球缀合至具有与第一寡核苷酸相同序列的第二寡核苷酸，所述寡核苷酸探针具有标记物和与第一和第二寡核苷酸互补的第三序列。在一个具体的实施例中，寡球是磁性的。本文件报道寡球的特定用途，作为标准化程序中的参考。
[0006]修饰的寡核苷酸，例如肽核酸(PNA)和锁核酸(LNA)已研究用于生理学应用。LNA在核糖部分的2
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氧和4
′-
碳之间具有亚甲基接头，其将糖锁定为C3-内构象，因此LNA称为“锁核酸”。在涉及通过杂交形成双链体的技术应用中，这种化学修饰赋予核酸酶抗性以及对寡核苷酸靶的更高的亲和力和更高的特异性。WO 1998/39352公开了锁核酸(LNA)结构。WO 2000/056746公开了LNA单体的合成，所述LNA单体包括用于LNA的某些立体异构体的中间产物。通过化学合成，可以合成仅由LNA核苷类似物单体组成的单链(“全LNA”)。
[0007]如上所述，锁核酸(LNA)单体是一种构象受限的核苷酸类似物，其在核糖环上添加了一个额外的2
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O、4
′-
C-亚甲基桥。LNA单体以2
′-
O、4
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C-亚甲基-(D-呋喃核糖基)核苷单体形式提供(Singh S.K.et al.Chem.Commun.4(1998)455-456；Koskin A.A.et al.Tetrahedron 54(1998)3607-3630；Wengel J.Acc.Chem.Res.32(1999)301-310)。WO 2000/066604和WO 2000/056746公开LNA核苷单体的某些立体异构体。包含DNA和LNA单体的混合DNA-LNA寡核苷酸显示出对3
′-
外切核酸降解的稳定性，并且当与互补的DNA和RNA杂交时，其热稳定性大大提高。实际上，与已合成的其他高亲和力核酸模拟物相比，例如与肽核酸(PNA)、己糖醇核酸(HNA)和2
′-
氟N3
′-
氨基磷酸酯相比，LNA表现出非凡的结合亲和力。Christensen U.等人报道了LNA-DNA混合寡核苷酸(也称为“混合体”)的杂交动力学(Biochem J 354(2001)481-484)。Eichert A.等人报道了由两个互补的ss-寡核苷酸组成的双链体的晶体结构，每个互补ss-寡核苷酸均由7个LNA单体组成(Nucleic Acids Research 38(2010)6729-6736)。
[0008]WO 1999/14226建议在亲和对的构建中使用LNA以附着到目的分子和固体支持物上。然而，本领域也已知互补的全LNA单链的杂交具有的技术问题。全LNA杂交的热力学分析在很大程度上是凭经验进行的，到目前为止，似乎不可能进行没有事先变性步骤(例如在杂交之前加热)的杂交单体的序列预测。
[0009]到目前为止，大多数情况下都分析了混合的LNA-DNA寡核苷酸(也称为“混合体单链”或“混合体”)。迄今为止，仅有特别是由Koshkin A.A.等人(J Am Chem Soc 120(1998)13252-13253)和B.P.等人(Analyst 130(2005)1634-1638)发表的关于仅由LNA单体制成的杂交单链寡核苷酸(即“全LNA”单链寡核苷酸)的表征的较少报道。Ez本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】L-LNA单体组成。13.一种液体组合物，其包含水性溶剂以及由第一单链寡核苷酸和第二单链寡核苷酸组成的结合对，其中每个寡核苷酸由8个至15个锁核酸(＝LNA)单体组成，每个单体包含核碱基，所述单体的核碱基形成第一寡核苷酸的第一核碱基序列和第二寡核苷酸的第二核碱基序列，其中选择所述第一核碱基序列和所述第二核碱基序列，以使所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸能够在20℃至40℃的温度下形成8个至15个连续Watson-Crick碱基对的反平行双链体，并且其中所述结合对可通过根据权利要求项1至12中任一项所述的方法获得。14.根据权利要求项13所述的组合物，其中，每个寡核苷酸由8个至15个LNA单体组成，其中选择所述第一核碱基序列和所述第二核碱基序列，使得所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸能够在20℃至40℃的温度下形成5个至9个连续Watson-Crick碱基对的反平行双链体，并且其中所述结合对可通过根据权利要求项2至12中任一项所述的方法获得。15.根据权利要求项14所述的组合物，其中，每个寡核苷酸由9个至15个LNA单体组成，其中选择所述第一核碱基序列和所述第二核碱基序列，以使所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸能够在20℃至40℃的温度下形成9个连续...

【专利技术属性】
技术研发人员：F，
申请(专利权)人：豪夫迈，
类型：发明
国别省市：