短RNA片段文库的构建方法、试剂盒及应用技术

本发明专利技术涉及基因测序领域，具体涉及一种短RNA片段文库的构建方法、试剂盒及应用。该构建方法包括将短RNA片段样本进行预磷酸化和去磷酸化处理，使得所述短RNA片段中3

【技术实现步骤摘要】
短RNA片段文库的构建方法、试剂盒及应用


[0001]本专利技术涉及基因测序领域，具体涉及一种短RNA片段文库的构建方法、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]细胞外RNA(Extracellular RNA或exRNAs)在生命科学领域有极高的研究价值，应用于液体活检领域等更是研究热点。目前已知exRNAs中包括含多种短RNA片段，如miRNA、siRNA、snoRNA等，更包括大量长RNA(如mRNA、long non-coding RNA等)的降解片段。这些片段在细胞外可能执行着重要功能，但目前短RNA片段(small RNA)的建库测序流程仅能研究其中的miRNA组分，其他核酸序列无法被获取到。
[0003]由此，针对短RNA片段文库的建库测序流程还需要进一步改进，以尽量检测其他短RNA片段组分。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种短RNA片段文库的构建方法及试剂盒。
[0005]本专利技术的专利技术人在研究过程中发现：
[0006]如图1所示，目前Small RNA文库构建流程通常如下：1)电泳分离total RNA，并回收18-30nt的组分；2)在small RNA两端依次连接3
’
接头和5
’
接头；3)所获得的连接产物进行反转录和PCR扩增，得到small RNA文库。然而在步骤2)利用酶在small RNA两端连接3
’
>接头和5
’
接头的过程中，只能以5
’
端为磷酸基且3
’
端为羟基末端的RNA序列为反应底物，而当RNA末端为5
’
三磷酸基(5
’
triphosphate)、5
’
羟基或3
’
磷酸基时，以上两款酶连接效率极低。
[0007]然而细胞外RNA包括含多种短RNA片段，如miRNA、siRNA、snoRNA等，更包括大量长RNA(如mRNA、long non-coding RNA等)的降解片段。其中，miRNA在成熟过程中由Dicer酶剪切加工，成熟miRNA的结构特点为5
’
磷酸基且3
’
羟基。siRNA在成熟过程中由RdRP酶加工，成熟siRNA的结构特点为5
’
三磷酸基且3
’
羟基。长RNA的降解片段则是经过了RNase A剪切，结构特点为5
’
羟基且3
’
磷酸基。按照现有的Small RNA建库方法，除miRNA外，其他短RNA片段均不能被测得。然而已有的研究表明，siRNA在器官发育过程中起到了重要作用，而长RNA的降解片段则扮演着在细胞间传递遗传信息或特异性的RNA结合蛋白等作用。这两类短RNA片段都有极高的研究价值，但现有的Small RNA建库方法无法开展。
[0008]专利技术人在研究过程中发现：T4多聚核苷酸激酶(T4Polynucleotide Kinase，缩写为T4PNK)同时具有5
’
磷酸化酶活性和3
’
磷酸酶活性，常用于基因克隆实验。反应底物多为双链DNA。可以将其应用于修饰长RNA的降解片段，使长RNA的降解片段的5
’
羟基3
’
磷酸基改变为5
’
磷酸基3
’
羟基。RNA5
’
焦磷酸水解酶(RNA 5'Pyrophosphohydrolase，缩写为RppH)具有焦磷酸水解酶活性，可以将长RNA 5
’
三磷酸基水解脱焦磷酸得到5
’
磷酸基，常用于mRNA
的脱帽反应及转录起始位点研究。因此也可以将其应用于修饰siRNA，使SiRNA的5
’
三磷酸基改变为5
’
磷酸基。同时，RppH的脱帽活性可以帮助捕获mRNA的5
’
降解片段。借助于这些酶对短RNA片段样本进行处理，使得处理后的短RNA片段样本能够利用常规Small RNA分子文库构建的手段进行建库，测序，从而获知这些短RNA片段的信息，用于科研或者临床分析等。当然，如果其他的核酸酶也可以实现上述功能，例如能够将RNA分子的3
’
端转化为3
’
羟基，从而适于与3
’
接头连接；或者能够将RNA分子5
’
端转化为仅带有一个磷酸基，从而适于与5
’
接头连接，其主旨与本专利技术相同，也可以应用于本专利技术。这些核酸酶也可以包含在本专利技术的保护范围之内。
[0009]具体而言，本专利技术提供了如下技术方案：
[0010]根据本专利技术的第一方面，一种短RNA片段文库的构建方法，包括：将短RNA片段样本进行预磷酸化和去磷酸化处理，使得所述短RNA片段中3
’
端磷酸基修饰为羟基，5
’
端羟基修饰为磷酸基，获得第一产物；将所述第一产物与3
’
接头进行第一连接，以便获得连接有3
’
接头的第一连接产物；将所述连接有3
’
接头的第一连接产物进行脱磷酸处理，以便获得5
’
端为磷酸基的第二产物；将所述5
’
端为磷酸基的第二产物与5
’
接头进行第二连接，以便获得连接有5
’
接头和3
’
接头的第二连接产物；将所述连接有5
’
接头和3
’
接头的第二连接产物进行反转录，扩增获得所述短RNA片段文库。
[0011]通过对短RNA片段样本进行预磷酸化和去磷酸化处理，可以使得短RNA片段样本中例如长片段降解片段的3
’
端磷酸基修饰为3
’
羟基，5
’
端羟基修饰为5
’
磷酸基，使得修饰后的短RNA片段适于连接3
’
接头和5
’
接头；然后将连接有3
’
接头的第一连接产物进行脱磷酸处理，使得某些短RNA片段中的5
’
端的多个磷酸基修饰为一个磷酸基，以便于和5
’
接头连接，获得连接有5
’
接头和3
’
接头的第二连接产物。通过对第二连接产物进行反转录，扩增能够获得短RNA片段文库。所获得的短RNA片段文库中包含有长片段降解片段，miRNA，siRNA等众多短RNA片段，通过测序可以获知这些短RNA片段的信息，这些分子在生命科学领域起着重要的功能，通过这些信息，可以应用于科研或者临床治疗和研究中。
[0012]根据本专利技术的实施例，以上所述短RNA片段文库的构建方法可以进一步包括如下技术特征：
[0013]在本专利技术的一些实施例中，将所述短RNA片段样本和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种短RNA片段文库的构建方法，其特征在于，包括：将短RNA片段样本进行预磷酸化和去磷酸化处理，使得所述短RNA片段中3
’
端磷酸基修饰为羟基，5
’
端羟基修饰为磷酸基，获得第一产物；将所述第一产物与3
’
接头进行第一连接，以便获得连接有3
’
接头的第一连接产物；将所述连接有3
’
接头的第一连接产物进行脱磷酸处理，以便获得5
’
端为磷酸基的第二产物；将所述5
’
端为磷酸基的第二产物与5
’
接头进行第二连接，以便获得连接有5
’
接头和3
’
接头的第二连接产物；将所述连接有5
’
接头和3
’
接头的第二连接产物进行反转录，扩增获得所述短RNA片段文库。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将所述短RNA片段样本和T4多聚核苷酸激酶进行第一混合孵育，以便进行所述预磷酸化和去磷酸化处理。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将所述连接有3
’
接头的第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：宗亮，陈翠，徐怀前，田志坚，
申请(专利权)人：武汉华大医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：