一种快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞增殖效率的增殖培养基及增殖培养方法技术

本发明专利技术提供一种快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞(Bone marrow

【技术实现步骤摘要】
一种快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞增殖效率的增殖培养基及增殖培养方法


[0001]本专利技术属于细胞培养领域，具体涉及一种快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞增殖效率的增殖培养基及增殖培养方法。

技术介绍

[0002]国内外研究证明，体外培养获取的哺乳类动物BM-MSCs具有多向或跨胚层分化潜能，可分化为多种用于修复的功能细胞，例如分化为肝、胆、胰、肺、肾、软骨、脑、视网膜、肠、脾、血液、皮肤等功能细胞。说明BM-MSCs在适当培养环境下，可被诱导多向功能分化，进而促进修复再生。目前已有临床案例证明，BM-MSCs可以被移植到患者体内，成功修复损伤性疾病，如用于诱导骨缺损再生[1]和梗塞心肌再生[3]等，尤其在治疗移植物抗宿主反应(Graft-Versus-Host-Reaction GVHR)方面效果甚佳[4]。由于BM-MSCs具有易培养，免疫调节和促进内源性修复等特性，故成为治疗各种疾病的优选细胞。在细胞治疗和组织工程上拥有越来越广阔的前景。然而，目前学术界体外培养BM-MSCs面临的难题主要有2点：(1)动物源性血清的必须性。目前学术界体外培养BM-MSCs均需要胎牛或小牛血清((FCS或FBS)，而小(肽)牛血清为动物源性，其异源和未知毒性限制了临床应用；(2)临床所需BM-MSCs的高剂量性。BM-MSCs临床治疗通常需要约109个左右高剂量细胞,体外培养一次性获取此剂量成本较高。如果采用干细胞库中冻存复苏的BM-MSCs，因需含特殊成分培养基保持细胞活性和后期使用所需剂量，成本更高。因此，如何克服动物异源性血清影响，改进BM-MSCs培养方法，提高其扩增效率和同时保持其良好干性，是达到提升临床疗效的关键。
[0003]培养基是构成细胞体外培养环境的重要因素，虽然基础培养基加适量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞包括BM-MSCs培养的要求，但由于上述毒副作用，限制了临床应用。无血清培养基是不需要添加血清即可维持干细胞体外长时间生长的合成培养基，其工作基础是用合适的无害有效成分如激素、营养物和促贴壁物质的组合置换培养基的成分。例如在无血清培养基中添加细胞因子如IL-3,SCF，Fit3-L,IL-6等[1，2],营养蛋白如白蛋白，人转铁蛋白等[3，4]和血小板替代品[5]等技术。在某些培养方案中，细胞直接进入无血清培养，可以消除来自血清的不均一性。
[0004]在BM-MSCs的快速扩增和扩增效率等方面，寻找更合适的培养基及培养方法，达到BM-MSCs数量级增殖的要求，是医疗科研工作者们一直力求突破的关键。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种维持良好生长、抑制分化(走向衰老)、维持干性、促进快速大量扩增和快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)增殖率的增殖培养基及增殖培养方法。
[0006]为达到上述目的，本专利技术提供一种快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞BM-MSCs增殖率的增殖培养基(ZEzh培养基),所述培养基包括：氨基酸、维生素、无机盐、碳源、
缓冲液和指示剂，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐，L-天冬酰胺-H2O，半胱氨酸，L-组氨酸盐酸盐-H2O，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸盐酸盐，L-蛋氨酸，L-苯丙氨酸，脯氨酸，L-丝氨酸，苏氨酸，L-色氨酸，酪氨酸和缬氨酸；所述维生素包括：氯化胆碱，D-泛酸钙，叶酸，烟酰胺，盐酸吡醛，核黄素，盐酸硫胺素，维生素B12和肌醇；所述无机盐包括：无水氯化钙，硝酸铁，无水氯化镁，氯化钾，碳酸氢钠，氯化钠，磷酸二氢钠和硫酸锌；所述碳源包括：葡萄糖和丙酮酸钠，所述缓冲液为：羟乙基哌秦乙硫磺酸HEPES缓冲液；所述指示剂为：酚红。
[0007]进一步，所述氨基酸包括：甘氨酸27-33mg/L、丙氨酸1-4mg/L、L-精氨酸盐酸盐75-92mg/L，L-天冬酰胺-H2O 0.80-0.86mg/L，半胱氨酸30-33mg/L，L-组氨酸盐酸盐-H2O 41-45mg/L，L-异亮氨酸101-109mg/L，L-亮氨酸102-107mg/L，L-赖氨酸盐酸盐142-148mg/L，L-蛋氨酸27-33mg/L，L-苯丙氨酸62-68mg/L，脯氨酸7.02-7.82/L，L-丝氨酸40-45mg/L，苏氨酸92-97mg/L，L-色氨酸14-18mg/L，酪氨酸70-74mg/L和缬氨酸91-96mg/L；所述维生素包括：氯化胆碱3-5mg/L，D-泛酸钙3-6mg/L，叶酸3-6mg/L，烟酰胺3-7mg/L，盐酸吡醛3-7mg/L，核黄素0.3-0.7mg/L，盐酸硫胺素3-6mg/L，维生素B12 0.0065-0.0071mg/L和肌醇6.6-7.4mg/L；所述无机盐包括：无水氯化钙198-202mg/L，硝酸铁0.05-0.15mg/L，无水氯化镁75.3-78.1mg/L，氯化钾398-404mg/L，碳酸氢钠2198-2206mg/L，氯化钠3992-4006mg/L，磷酸二氢钠121-130mg/L和硫酸锌0.191-0.196mg/L；所述碳源包括：葡萄糖4490-4504mg/L和丙酮酸钠23-27mg/L，所述缓冲液为：羟乙基哌秦乙硫磺酸HEPES缓冲液2593-2604mg/L；所述指示剂为：酚红7.8-8.5mg/L。
[0008]进一步，所述氨基酸包括：甘氨酸30mg/L、丙氨酸2mg/L、L-精氨酸盐酸盐84mg/L，L-天冬酰胺-H2O 0.83mg/L，半胱氨酸31.5mg/L，L-组氨酸盐酸盐-H2O 42.0mg/L，L-异亮氨酸105mg/L，L-亮氨酸105mg/L，L-赖氨酸盐酸盐146mg/L，L-蛋氨酸30mg/L，L-苯丙氨酸66mg/L，脯氨酸7.76/L，L-丝氨酸42mg/L，苏氨酸95mg/L，L-色氨酸16mg/L，酪氨酸72mg/L和缬氨酸94mg/L；所述维生素包括：氯化胆碱4mg/L，D-泛酸钙4mg/L，叶酸4mg/L，烟酰胺4mg/L，盐酸吡醛4mg/L，核黄素0.4mg/L，盐酸硫胺素4mg/L，维生素B12 0.0068mg/L和肌醇7.2mg/L；所述无机盐包括：无水氯化钙200mg/L，硝酸铁0.1mg/L，无水氯化镁77.3mg/L，氯化钾400mg/L，碳酸氢钠2200mg/L，氯化钠4000mg/L，磷酸二氢钠125mg/L和硫酸锌0.194mg/L；所述碳源包括：葡萄糖4500mg/L和丙酮酸钠25mg/L，所述缓冲液为：羟乙基哌秦乙硫磺酸HEPES缓冲液2600mg/L；所述指示剂为：酚红8.1mg/L。
[0009]本专利技术还提供所述增殖培养基的配制方法,所述配制方法包括：取除水外的组分，根据其各自溶解特性分类溶解，然后混合，加入水使各组分终浓度如上述中任一项培养基，调节pH值至7.0～7.4，即得。
[0010]本专利技术还提供所述增殖培养基用于哺乳类动物BM-MSCs的培养方法，所述培养方法包括：1)哺乳类动物骨髓间充质干细胞的获取；2)原代培养；3)传代培养；4)增殖培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速提升哺乳类动物骨髓间充质干细胞BM-MSCs增殖率的增殖培养基,其特征在于，所述培养基包括：氨基酸、维生素、无机盐、碳源、缓冲液和指示剂，所述氨基酸包括：甘氨酸、丙氨酸、L-精氨酸盐酸盐，L-天冬酰胺-H2O，半胱氨酸，L-组氨酸盐酸盐-H2O，L-异亮氨酸，L-亮氨酸，L-赖氨酸盐酸盐，L-蛋氨酸，L-苯丙氨酸，脯氨酸，L-丝氨酸，苏氨酸，L-色氨酸，酪氨酸和缬氨酸；所述维生素包括：氯化胆碱，D-泛酸钙，叶酸，烟酰胺，盐酸吡醛，核黄素，盐酸硫胺素，维生素B12和肌醇；所述无机盐包括：无水氯化钙，硝酸铁，无水氯化镁，氯化钾，碳酸氢钠，氯化钠，磷酸二氢钠和硫酸锌；所述碳源包括：葡萄糖和丙酮酸钠，所述缓冲液为：羟乙基哌秦乙硫磺酸HEPES缓冲液；所述指示剂为：酚红。2.按照权利要求1所述的增殖培养基,其特征在于，所述氨基酸包括：甘氨酸27-33mg/L、丙氨酸1-4mg/L、L-精氨酸盐酸盐75-92mg/L，L-天冬酰胺-H2O 0.80-0.86mg/L，半胱氨酸30-33mg/L，L-组氨酸盐酸盐-H2O 41-45mg/L，L-异亮氨酸101-109mg/L，L-亮氨酸102-107mg/L，L-赖氨酸盐酸盐142-148mg/L，L-蛋氨酸27-33mg/L，L-苯丙氨酸62-68mg/L，脯氨酸7.02-7.82/L，L-丝氨酸40-45mg/L，苏氨酸92-97mg/L，L-色氨酸14-18mg/L，酪氨酸70-74mg/L和缬氨酸91-96mg/L；所述维生素包括：氯化胆碱3-5mg/L，D-泛酸钙3-6mg/L，叶酸3-6mg/L，烟酰胺3-7mg/L，盐酸吡醛3-7mg/L，核黄素0.3-0.7mg/L，盐酸硫胺素3-6mg/L，维生素B12 0.0065-0.0071mg/L和肌醇6.6-7.4mg/L；所述无机盐包括：无水氯化钙198-202mg/L，硝酸铁0.05-0.15mg/L，无水氯化镁75.3-78.1mg/L，氯化钾398-404mg/L，碳酸氢钠2198-2206mg/L，氯化钠3992-4006mg/L，磷酸二氢钠121-130mg/L和硫酸锌0.191...

【专利技术属性】
技术研发人员：白莲花，将师放，林恒，赖洁娟，张玉君，陈泉余，张宏宇，张雷达，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：