一种用于鉴定CHO细胞的SCAR标记及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种用于鉴定CHO细胞的SCAR标记及其构建方法和应用，利用CHO细胞基因组的特异性，以亲缘关系较近的BHK

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴定CHO细胞的SCAR标记及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物
，具体涉及一种用于鉴定CHO细胞的SCAR标记及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]治疗性重组蛋白在制药工业中增长非常迅速，全球在血液制品，单克隆抗体和激素等生物制药领域的投入在2010年就达到了1380亿美元。中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamsterovary cell,CHO)是由美国学家Theodore T.Puck于1957年从一只雌性的中国仓鼠中分离得到的，因其具有易于悬浮培养且能够产生高浓度的治疗性蛋白等优势，在生物制品领域中得到了广泛的应用。目前，CHO细胞是生产治疗性重组蛋白最主要的宿主细胞。
[0003]细胞系的错误识别和交叉污染是细胞培养的的主要问题，极大的影响了生物制品的生产。国际人用药品注册技术协调会(International Conference on Harmonisation,ICH)明确指出MCB、WCB和EPC等细胞库要进行细胞鉴定。《中华人民共和国药典》2020年版三部中也明确规定新建细胞系/株、细胞库(MCB和WCB)和生产终末细胞应进行鉴别试验，以确认为本细胞，且无其他细胞的交叉污染。其中规定的细胞鉴定试验有很多种，包括细胞形态、生物化学、免疫学、细胞遗传学检测和PCR等方法。应至少选择一种或几种方法对细胞进行种属和细胞株间及专属特性的鉴别，以确保生物制品的质量。
[0004]目前，对于CHO细胞的鉴定主要是采用同工酶技术和核型分析技术等方法，此类方法操作复杂、耗时长、费用高且准确度低。随机扩增多态性DNA(random amplifiedpolymorphic DNA,RAPD)技术是1990年专利技术的一项分子标记技术，其原理是采用较短的引物(9bp或者10bp)对基因组进行聚合酶链式反应，并可对未知序列的基因组进行多态性分析，从而实现物种鉴定的目的。序列特征扩增区域(sequence characterized amplified regions,SCAR)技术是在RAPD技术基础上建立的更加稳定的标记技术。SCRA标记技术仅仅需要少量物种基因组DNA就能够实现对物种的快速鉴定，具有操作简单、用时短、稳定性强和灵敏度高等特点。然而到目前为止，尚未有SCAR技术在CHO细胞鉴定方面的相关报道。

技术实现思路

[0005]为了克服上述现有技术存在的不足，本专利技术的目的是提供一种用于鉴定生物制品生产和科研类等CHO细胞的SCAR标记及其构建方法和应用，只需要获得CHO细胞的基因组模板就能够实现对CHO细胞的鉴定，具有操作方便、简单、实验结果稳定、特异性强和灵敏度高等特点，在生物制品和科研类等CHO细胞质量控制方面具有非常重要的作用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术的技术方案为一种用于鉴定CHO细胞的SCAR标记，所述SCAR标记包括SA-SCAR、SB-SCAR1、SB-SCAR2中的任意一种；
[0007]其中，
[0008]所述SA-SCAR的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
[0009]所述SB-SCAR1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
[0010]所述SB-SCAR2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0011]进一步地，上述SCAR标记中，
[0012]所述SA-SCAR的引物对核苷酸序列为：
[0013]SA-SCAR-F：TCCCGTTCAAGATGGAGGCGC；
[0014]SA-SCAR-R：AGGAAACAGCTTACATGCCGA；
[0015]所述SB-SCAR1的引物对核苷酸序列为：
[0016]SB-SCAR-F1：TCATGACAAGGAGCCAATCGG；
[0017]SB-SCAR-R1：AGATCTTATAGGGCAGCGTAAG；
[0018]所述SB-SCAR2的引物对核苷酸序列为：
[0019]SB-SCAR-F2：TTGCCCTCACCTTACCGATG；
[0020]SB-SCAR-R2：TTGCACTAACCATTGCCTC。
[0021]本专利技术还提供上述的用于鉴定CHO细胞的SCAR标记的构建方法，包括如下步骤：
[0022]1)分别收集CHO细胞和BHK-21细胞，并提取DNA；
[0023]2)分别采用RAPD引物SA和RAPD引物SB对提取的两种细胞DNA进行PCR扩增；
[0024]3)分别对两种细胞DNA的扩增产物进行电泳检测；与细胞BHK-21相比，CHO细胞用RAPD引物SA扩增的产物中出现一条特异性条带，CHO细胞用RAPD引物SB扩增的产物中出现两条特异性条带；
[0025]4)对步骤3)中获得的三条特异性条带进行回收纯化后测序，分别获得SA-SCAR、SB-SCAR1、SB-SCAR2的核苷酸序列；
[0026]5)根据步骤4)获得的SA-SCAR、SB-SCAR1、SB-SCAR2的核苷酸序列，分别设计三对引物；
[0027]6)分别采用步骤5)设计的三对引物对CHO细胞和BHK-21细胞进行PCR扩增。
[0028]进一步地，上述构建方法的步骤2)中，RAPD引物SA的核苷酸序列为：GAAACGGGTG；RAPD引物SB的核苷酸序列为：TGGGGGACTC。
[0029]进一步地，上述构建方法的步骤2)中，RAPD扩增的PCR反应体系为：2X rapid taq Mix 10ul，10uM引物1ul，100ng/ul模板2ul，水7ul。
[0030]进一步地，上述构建方法的步骤2)中，RAPD扩增的PCR反应条件为：
①
95℃4min；
②
95℃15s；
③
37.5℃15s；
④
72℃1min；以上
②-④
重复35个循环；
⑤
72℃5min；
⑥
16℃store。
[0031]进一步地，上述构建方法的步骤6)中，采用SA-SCAR、SB-SCAR1、SB-SCAR2的引物对扩增时，PCR反应条件为：
①
95℃4min；
②
95℃15s；
③
56℃/58℃/60℃15s；
④
72℃15s；以上
②-④
重复35个循环；
⑤
72℃5min；
⑥
16℃store。
[0032]本专利技术还提供上述的用于鉴定CHO细胞的SCAR标记在鉴定CHO细胞中的应用。
[0033]采用上述SCAR标记鉴定CHO细胞时，鉴定方法包括如下步骤：
[0034]1)对待鉴定样品提取DNA；
[0035]2)以提取的样品DNA为模板，采用SA-SCAR、SB-SCAR1或SB-SCAR2的引物对进行PCR扩增；...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴定CHO细胞的SCAR标记，其特征在于：所述SCAR标记包括SA-SCAR、SB-SCAR1、SB-SCAR2中的任意一种；其中，所述SA-SCAR的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述SB-SCAR1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述SB-SCAR2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。2.如权利要求1所述的SCAR标记，其特征在于：所述SA-SCAR的引物对核苷酸序列为：SA-SCAR-F：TCCCGTTCAAGATGGAGGCGC；SA-SCAR-R：AGGAAACAGCTTACATGCCGA；所述SB-SCAR1的引物对核苷酸序列为：SB-SCAR-F1：TCATGACAAGGAGCCAATCGG；SB-SCAR-R1：AGATCTTATAGGGCAGCGTAAG；所述SB-SCAR2的引物对核苷酸序列为：SB-SCAR-F2：TTGCCCTCACCTTACCGATG；SB-SCAR-R2：TTGCACTAACCATTGCCTC。3.权利要求1或2所述的用于鉴定CHO细胞的SCAR标记的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1)分别收集CHO细胞和BHK-21细胞，并提取DNA；2)分别采用RAPD引物SA和RAPD引物SB对提取的两种细胞DNA进行PCR扩增；3)分别对两种细胞DNA的扩增产物进行电泳检测；与细胞BHK-21相比，CHO细胞用RAPD引物SA扩增的产物中出现一条特异性条带，CHO细胞用RAPD引物SB扩增的产物中出现两条特异性条带；4)对步骤3)中获得的三条特异性条带进行回收纯化后测序，分别获得SA-SCAR、SB-SCAR1、SB-SCAR2的核苷酸序列；5)根据步骤4)获得的SA-SCAR、SB-SCAR1、SB-SCAR2的核苷酸序列，分别设计三对引物；6)分别采用步骤5)设计的三对引物对CHO细胞和BHK-21细胞进行PCR扩增。4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤2)中，RAPD引物SA的核苷酸序列为：GAAACGGGTG；RAPD引物SB的核苷酸序列为：TGGGGGACTC。5.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤2)中，RAPD扩增的PCR反应体系为：2X rapid taq Mix 10ul，10u...

【专利技术属性】
技术研发人员：臧照星，刘愈杰，徐国东，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：