一种本生烟NbPLP基因多克隆抗体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种本生烟NbPLP基因多克隆抗体及其制备方法和应用，包括(1)构建含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得NbPLP蛋白；(2)以所述NbPLP蛋白为抗原免疫动物，经血清分离纯化获得NbPLP蛋白多克隆抗体，利用本发明专利技术所提供的方法制备的多克隆抗体，能够特异性识别本生烟NbPLP，在本生烟NbPLP蛋白的检测和功能鉴定及其研究中具有广泛用途。NbPLP蛋白抗体的制备为检测本生烟NbPLP基因在病毒侵染过程中的表达情况及研究NbPLP蛋白的功能具有重要意义。的功能具有重要意义。的功能具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种本生烟NbPLP基因多克隆抗体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于植物病毒检测的生物技术产品
，具体涉及一种本生烟NbPLP基因多克隆抗体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]本生烟(Nicotiana benthamiana)原产于澳洲，与辣椒、番茄、马铃薯及栽培烟草等一样，属于茄科(Solanaceae)，是含有19条染色体的异源四倍体植物，目前尚无注释完整基因组数据。本生烟是重要模式植物之一，在植物与微生物互作、鉴定蛋白质相互作用及亚细胞定位等方面被广泛应用。因此，对其开展功能基因的研究，对于分子生物学的发展具有重要意义。
[0003]本生烟光诱导蛋白(Nicotiana benthamiana light-induced protein)，简称NbPLP。NbPLP是叶绿素a/b结合蛋白家族的成员，在早期叶绿体的发育和非生物胁迫期间参与光合作用的机制的组装和修复，而目前关于NbPLP蛋白的抗体未见报道。因此，发展NbPLP的快速检测鉴定技术迫在眉睫。

技术实现思路

[0004]目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供一种本生烟NbPLP基因多克隆抗体及其制备方法和应用。
[0005]技术方案：为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：
[0006]第一方面，提供一种本生烟NbPLP基因，所述基因的核苷酸序列如SED ID NO：1所示。
[0007]第二方面，提供一种本生烟NbPLP重组蛋白，其氨基酸序列如SED ID NO：2所示。
[0008]第三方面，提供一种多克隆抗体，是以所述的本生烟NbPLP重组蛋白为抗原，免疫动物制备所得。
[0009]第四方面，提供所述的本生烟NbPLP重组蛋白/所述多克隆抗体在NbPLP检测中的应用。
[0010]上述的本生烟NbPLP重组蛋白的制备方法，包括：
[0011]a)用PCR方法扩增序列如SED ID NO：1所示的本生烟NbPLP基因；
[0012]b)构建重组质粒：将本生烟NbPLP基因连接到原核表达载体pET-28a得到重组质粒pET-28a-NbPLP；
[0013]重组蛋白的诱导表达：将重组质粒pET-28a-NbPLP转化入大肠杆菌感受态细胞中，培养，诱导，裂解，纯化，得到本生烟NbPLP重组蛋白。
[0014]所述的本生烟NbPLP重组蛋白的制备方法，PCR方法扩增时，以本氏烟叶片的总RNA为模版，使用引物：上游引物NbPLPF如SEQ ID NO.3所示和下游引物NbPLPR如SEQ ID NO.4所示进行扩增。
[0015]在一些实施例中，所述大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL21感受态细胞。
[0016]上述的多克隆抗体的制备方法，以所述的本生烟NbPLP重组蛋白为抗原，采用常规多克隆抗体的制备方法制备抗血清，将抗血清分离纯化得到多克隆抗体。
[0017]在一些实施例中，所述多克隆抗体的制备方法，包括：将所述的本生烟NbPLP重组蛋白作为抗原注入兔子体内，四次免疫后，采集兔血，分离血清，纯化后得到本生烟NbPLP蛋白抗兔多克隆抗体。
[0018]进一步的，将本生烟NbPLP重组蛋白浓度调整为1mg/mL作为抗原注射；佐剂和抗原为1:1体积比抽取；首免采用完全佐剂，二-四免采用不完全佐剂。
[0019]本申请中一种本生烟NbPLP基因多克隆抗体的制备方法，包括：
[0020](1)构建含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组表达载体，将所述重组表达载体转化大肠杆菌感受态细胞获得重组蛋白抗原；
[0021](2)将所述NbPLP蛋白抗原免疫新西兰大白兔动物，经血清分离纯化获得NbPLP蛋白多克隆抗体。NbPLP蛋白标准品的制备，以本生烟叶片的总RNA为模版，使用引物NbPLPF和NbPLPR扩增获得NbPLP基因，经酶切连接，克隆入pET-28a载体得到重组质粒pET28a-NbPLP，将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21菌株，37℃培养过夜，IPTG诱导表达，而后经镍柱亲和层析纯化得到大小为27kDa的蛋白。
[0022]其中，所述NbPLP的引物设计为：
[0023]NbPLPF:5
’-
CGGGATCCATGGCTTCCATCTCTTCTCTAAATCAAATTCC-3
’
；酶切位点BamH l
[0024]NbPLPR:5
’-
CCGCTCGAGCAAGAGGGGACTGCCTTCCTT；酶切位点Xho l
[0025](3)所述重组表达载体是将含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的片段克隆至原核表达载体获得的。
[0026]本专利技术对于所使用的大肠杆菌感受态细胞的种类没有特别的限制，只要能够适合重组表达载体在细胞中有效表达即可，优选的情况下，为了获得更好的表达效果，大肠杆菌感受态细胞为大肠杆菌BL21感受态细胞。
[0027]在本专利技术中，可以利用本领域常规适合于重组蛋白抗原的原核表达载体，优选的情况下，当所述原核表达载体为pET-28a时，重组蛋白抗原的表达效果更好。
[0028]在本专利技术所提供的方法中，免疫新西兰大白兔的步骤包括4次免疫，首先将纯化的重组蛋白抗原与完全弗氏佐剂混合后首免后第14d进行二免，而后将纯化的重组蛋白抗原与非完全弗氏佐剂混合后进行二免到四免间隔时间为7d，免疫剂量同第一次。
[0029]在本专利技术中，免疫动物时所使用的免疫剂量及与佐剂的混合比例都可以按照本领域常规的方法进行。免疫的动物包括但不限于新西兰大白兔。
[0030]兔子三免后第7天耳中动脉采小样血清检测，检测合格，7天后加免，加免完7天后可采集全血。
[0031]本专利技术还提供了利用本专利技术所述的方法制备的本生烟NbPLP蛋白多克隆抗体。所述多克隆抗体能够特异性的识别NbPLP蛋白中的特异性氨基酸片段SEQ ID NO.2，为NbPLP蛋白的特异性抗体。
[0032]SEQ ID No.2所示的氨基酸序列如下：
[0033]MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSMASISSLNQIPCKTLQITSQYSKPTSRISTLPLTSTNFPSISVKEFTNPKQKFIAQAKNYDKEDEWGPEVEQIKPSGGGVAVAEEEPPKEPSEIELLKKQLVDSFYGTNRGLSASSETRAEIVELITKLESMNPTPAPTEALPLLNGKWILAYTSFSGLFPLLSRGTLPLVRVEEISQTIDSEAFA
VQNSVVFAGPLATTSITTNAKFEVRSPKRVQIKFDEGIIGTPQLTDSIELPENVEFLGQKIDLSPFKGLVNSVQDTASSVAKSISSQPPIKFPISNSNAQSWLLTTYLDDELRISRGDGGSVFVLIKEGSPLLKPLEHHHHHHDPA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种本生烟NbPLP基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SED ID NO：1所示。2.一种本生烟NbPLP重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SED ID NO：2所示。3.一种多克隆抗体，其特征在于，是以权利要求2所述的本生烟NbPLP重组蛋白为抗原，免疫动物制备所得。4.权利要求2所述的本生烟NbPLP重组蛋白/权利要求3所述多克隆抗体在NbPLP检测中的应用。5.权利要求2所述的本生烟NbPLP重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括：a）用PCR方法扩增序列如SED ID NO：1所示的本生烟NbPLP基因；b）构建重组质粒：将本生烟NbPLP基因连接到原核表达载体pET-28a得到重组质粒pET-28a-NbPLP；重组蛋白的诱导表达：将重组质粒pET-28a-NbPLP转化入大肠杆菌感受态细胞中，培养，诱导，裂解，纯化，得到本生烟NbPLP重组蛋白。6.权利要求5所述的本生烟NbPLP重组蛋白的制备方法，其特征在于，PCR方...

【专利技术属性】
技术研发人员：张坤，庄新建，陈佳欢，徐红梅，贺振，甘海峰，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：