桑黄菌激光脉冲强光联合诱变菌株及其超声强化发酵方法技术

本发明专利技术公开了桑黄菌激光脉冲强光联合诱变菌株及其超声强化发酵方法，属于食品加工技术领域。桑黄菌菌株保藏编号为：CGMCC NO.17078，建议的分类命名为：鲍氏针层孔菌Inonotus baumii。本发明专利技术还公开了桑黄菌激光脉冲强光联合诱变菌株的超声强化发酵方法，与出发菌株比较，本发明专利技术诱变菌株JQ9发酵菌丝体产量提高了46.6％，菌丝体多糖、黄酮、多酚和三萜的产量分别提高了27.17％、68.18％、60.73％和3.6％。本发明专利技术的两段式超声波强化，兼顾了多糖和黄酮两种活性成分产量和含量的提升。与无超声比较，多糖和黄酮的产量分别提高了15.86％和45.04％，菌丝体多糖和黄酮的含量分别提高了25.15％和56.68％。别提高了25.15％和56.68％。别提高了25.15％和56.68％。

【技术实现步骤摘要】
桑黄菌激光脉冲强光联合诱变菌株及其超声强化发酵方法


[0001]本专利技术属于食品加工
，特别涉及桑黄菌激光脉冲强光联合诱变菌株及其超声强化发酵方法。

技术介绍

[0002]桑黄菌作为我国稀有大型真菌，具有明显的药用价值，并广泛应用于韩国、日本。桑黄的药用特性最早记载于《本草纲目》中，自古就有“如果得到附着在桑树上的黄色疙瘩，死人也可以复活”的说法，现代药理学研究证明桑黄菌具有多种药理作用。研究指出桑黄菌多糖、黄酮、粗三萜类化合物具有多种生物活性。近些年来桑黄的研究备受关注。尤其是桑黄菌多糖具有明显的抗肿瘤、抗癌等功效，同时具有明显的抗氧化、免疫调节等活性。但桑黄菌本身的生物学特性决定了桑黄菌在自然及人工栽培的条件下生长速度缓慢，因此很难满足医药需求；相关研究指出桑黄菌发酵菌丝体较子实体含有丰富的多糖、黄酮和多种有益矿物元素，并指出发酵菌粉同样具有开发价值。因此通过工业发酵获得桑黄菌菌丝体，是获取更多资源的途径之一。因此，通过研究桑黄菌液态深层培养条件来开发一种新颖，高效同时获得桑黄菌多糖和黄酮产物的方法成为备受关注的课题。
[0003]近年来，高强度超声波作为一种经济、简单、有效的工业手段经常被用来提高活细胞生物产量和以及代谢酶和一些次级代谢产物的量。有研究表明超声处理在促进细菌、真菌和植物培养过程中产生有价值产物起着重要的作用。本课题组曾经开展过利用超声波强化桑黄菌发酵，提高多糖产量的研究(张赫男.桑黄菌的物理诱变及其超声辅助发酵研究.江苏大学博士学位论文，2014)。研究结果表明，在发酵第3.8天、超声时间65min的条件下，多糖产量值为1.8g/L。但是这个方案没有考虑黄酮产量提升促进的问题。迄今为止通过利用超声波同时提高桑黄菌菌丝发酵胞内多糖和黄酮产量的文章或专利尚未见报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供桑黄菌激光脉冲强光联合诱变菌株及其超声强化发酵方法。
[0005]实现本专利技术的技术如下：
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：
[0007]桑黄菌激光脉冲强光联合诱变菌株及其超声强化发酵方法按照下述步骤进行：
[0008]在桑黄菌菌株(Phellinus igniarius JQ9)接种后，在26℃下进行发酵，总发酵时间是10天。第一段超声处理的目的是提高多糖的产量，处理条件为：在发酵的第2～6天施加超声波，每天施加2次，共处理5天，每次施加时长15min、超声频率为(20+40)kHz双频组合、超声功率密度40W/L、超声波间歇比为10:3；第二阶超声处理的目的是提高黄酮的产量，处理条件为：在发酵的第7～9天施加超声波，每天施加超声1次，共处理3天；每次时长10min，频率组合(20+40)kHz、功率密度120W/L、间歇比10:7。结束发酵后，对发酵液中的菌丝体、菌丝体多糖和黄酮分别进行提取与分析检测。
[0009]上述桑黄菌菌株(Phellinus igniarius JQ9)，保藏编号：CGMCC NO.17078；保藏
单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2019年3月6日；建议的分类命名为：鲍氏针层孔菌Inonotus baumii。
[0010]本专利技术的优点，表现在：
[0011](1)与原始菌株比较，诱变菌株JQ9发酵菌丝体产量提高了46.6％，菌丝体多糖、黄酮、多酚和三萜的产量分别提高了27.17％、68.18％、60.73％和3.6％。
[0012](2)两段式超声波强化，兼顾了多糖和黄酮两种活性成分产量和含量的提升。与无超声比较，多糖和黄酮的产量分别提高了15.86％和45.04％，菌丝体多糖和黄酮的含量分别提高了25.15％和56.68％。
附图说明
[0013]图1筛选诱变菌株和原始菌株的摇瓶发酵菌丝体产量。
[0014]图2为原始发菌株和诱变菌株菌丝体显微镜观察。
[0015]图3为诱变菌株JQ9系统进化树分析。
[0016]图4为诱变菌株JQ9和原始菌株之间的拮抗现象。
[0017]图5为诱变菌株和原始菌株之前的同工酶电泳分析。
[0018]图6为诱变菌株JQ9和原始菌株RAPD快速扩增。
具体实施方式
[0019]本专利技术桑黄菌菌株(Phellinus igniarius JQ9)，保藏编号：CGMCC NO.17078；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2019年3月6日；建议的分类命名为：鲍氏针层孔菌Inonotus baumii。
[0020]上述菌株是通过采用He-Ne激光-脉冲强光联合处理桑黄菌原生质体，利用含有愈创木酚的甘露醇突变体筛选平板上进行初步筛选，经过5代的初筛及5代传代复筛最终获得的，诱变和筛选过程，按照以下步骤进行：
[0021]步骤一：
[0022]原生质体的制备与诱变：(Phellinus igniarius)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CGMCC NO.5.95。
[0023]1.1菌株活化及培养：
[0024]将斜面保藏的原始菌株(附图中CK)(Phellinus igniarius，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为CGMCC NO.5.95)接种在含有桑枝粉的PDA培养基的平板上进行培养，当菌株生长7d后待用；取改良PDA平板上生长旺盛的菌丝块(5mm
×
5mm)5块，接种在容量为250mL的包含有100mL的种子培养基的三角瓶中，26℃恒温静止培养10天。
[0025]1.2原生质体的制备：
[0026]种子培养液经过4℃低温高速离心机离心，10000
×
g，10min，获得桑黄菌菌丝体，再用无菌蒸馏水将菌丝体清洗3遍，4℃，10000
×
g离心10min，目的是为除去菌丝体表面的培养基。用无菌滤纸将洗涤好的菌丝体表面水分吸去。取0.4g湿菌丝体于1.5mL灭菌EP管中，加入1mL混合酶解液(经0.22μm细菌过滤器过滤除菌)(酶解液包含有1％溶壁酶和0.25％崩溃酶和终浓度为0.6mol/L的甘露醇作为渗透压稳定剂)，30℃，120r/min恒温振
荡，酶解3h。用G-3砂心漏斗过滤，将收集的滤液在4℃、3500r/min条件下离心10min，弃上清，沉淀用0.6mol/L的甘露醇洗涤2-3次，得到纯化的原生质体。
[0027]1.3原生质体的诱变：
[0028]原生质体的制备按照上述方法，并用血球计数板计数将原生质体稀释至1
×
106个/mL，吸取1mL稀释液于2mL离心管中，先进行He-Ne激光处理，处理条件为：He-Ne激光处理条件参数为光斑直径为10mm，处理距离为距离心管口液面10cm，处理时间30min，再进行脉冲强光处理。将1mLHe-Ne激本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.桑黄菌激光脉冲强光联合诱变菌株，其特征在于桑黄菌菌株(Phellinus igniarius JQ9)，保藏编号为：CGMCC NO.17078，建议的分类命名为：鲍氏针层孔菌Inonotus baumii。2.桑黄菌激光脉冲强光联合诱变菌株及其超声强化发酵方法，其特征在于按照下述步骤进行：在桑黄菌菌株(Phellinus igniarius JQ9)接种后，在26℃下进行发酵，总发酵时间是10天；第一段超声处理的目的是提高多糖的产量，处理条件为...

【专利技术属性】
技术研发人员：马海乐，董亚婷，任晓锋，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：