一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用技术

本发明专利技术属于医药材料领域，涉及一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用。本发明专利技术还包括相应的抗体检测试纸条的制备方法，特别是涉及一种用于检测新型冠状病毒抗体检测的胶体金试纸条制备方法。本发明专利技术的胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法，包括以下步骤：金标抗体偶联物制备，采用抗人IgG/M/A的多克隆抗体偶联胶体金；病毒抗体捕获用抗原混合液制备，所述的病毒抗体捕获用抗原包括但不限于新型冠状病毒S蛋白、N蛋白、E蛋白或者新型冠状病毒S蛋白、N蛋白、E蛋白的活性片段；混合抗原，并在硝酸纤维素膜的检测线处固定抗原。本发明专利技术能够更有效、更快速、更特异性的检测新冠病毒总抗体，有助于提高新冠病毒抗体的检出率。抗体的检出率。

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用


[0001]本专利技术属于医药材料领域，涉及一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法及其应用。具体涉及一种新型冠状病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法，涉及一种新的抗体检测试纸条及其制备方法，特别是涉及一种用于检测新型冠状病毒抗体检测的试纸条及其制备方法，和应用。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒属于冠状病毒科。冠状病毒因其在显微镜下能观察到明显的棒状（Spike）粒子突起，形状好似帝王的皇冠而得名。冠状病毒分为α、β、γ以及δ四个冠状病毒属，新型冠状病毒（SARS-CoV-2）与引发2003年严重急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndromes，SARS）的SARS-CoV病毒，以及引发2012年中东呼吸综合征（Middle East Respiratory Syndrome，MERS）的MERS-CoV病毒都属于冠状病毒科β冠状病毒属(Betacoronavirus)。
[0003]SARS-CoV-2有四种结构蛋白：刺突糖蛋白（S，Spike protein）、小包膜糖蛋白（E，Envelop Protein）、膜糖蛋白（M, Membrane Protein）、和核衣壳蛋白（N蛋白）。S蛋白在识别并结合宿主细胞表面受体，介导病毒包膜与宿主细胞膜融合的过程中起至关重要作用。E蛋白的功能是组装病毒并充当粒子通道；M蛋白与E蛋白一起参与病毒包膜的形成与出芽过程；N蛋白与病毒RNA形成核糖核蛋白复合物，N蛋白是一种多功能结构蛋白，具有增强病毒基因组转录、破坏各种宿主细胞活动而对宿主细胞产生毒性等不同特征。
[0004]截至2020年4月10日，国家药品监督管理局一共审批通过了27个新冠检测试剂，其中18个是核酸检测试剂，9个抗体检测试剂。在获批的这9款抗体检测试剂中有3个产品是化学发光方法，其余6款产品则使用了胶体金标记方法来检测。
[0005]大部分新冠病毒抗体检测试剂盒使用胶体金标记新冠抗原，通常是S或N蛋白，在检测T线T1和T2分别包被抗人IgM抗体和抗人IgG抗体以实现对人体新冠病毒抗体IgG和IgM的分别检测。由于正常人的血清中含有大量的抗体，病毒免疫刺激后产生的特异性抗体占比很少，大量非特异性抗体会与胶体金标记的抗人IgG抗体发生竞争性结合，导致假阴性结果的产生。另外，如果IgM和IgG抗体的检测在同一支试纸条上，金颗粒被前端的抗人IgG捕获，会严重削弱IgM的检测信号，导致检测灵敏度下降。
[0006]希腊研究者汇集了世界各地的38项研究中涉及的7848个个体的血清学检测数据（新冠肺炎患者3522例，非新冠肺炎4326例），统计结果表明以检测新冠抗体IgG和IgM的灵敏度在0.53-0.66之间。

技术实现思路

[0007]本专利技术目的在于：提供一种胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法，在检测血清中病毒总抗体（IgA、IgM和IgG）的基础上，提高新冠抗体的检出率。
[0008]本专利技术的再一目的在于：提供一种上述检测的胶体金检测试纸。
[0009]本专利技术目的通过下述方案实现：提供一种新冠病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法，包括以下步骤：金标抗体偶联物制备，采用抗人的多克隆抗体偶联胶体金；病毒抗体捕获用抗原混合液制备，所述的病毒抗体捕获用抗原包括新型冠状病毒S蛋白、N蛋白或者新型冠状病毒S蛋白、N蛋白的活性片段；混合抗原，并在硝酸纤维素膜的检测线处固定抗原。
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nCoV（SARS-2）冠状病毒的结构基因组29883bp，基因组中包括了14个ORF框，较大的蛋白分子包括以下蛋白的区域，N：核衣壳蛋白；S：Spike蛋白；M：膜蛋白；HE：血凝素酯酶；E：包膜蛋白。感染细胞的主要是通过在S蛋白与细胞表明的ACE2结合进入细胞。所述的新型冠状病毒S蛋白或者N蛋白与我国卫生健康委员会的报道一致。
[0011]较好的，所述的识别新型冠状病毒抗体的抗原可以是新型冠状病毒S蛋白或者N蛋白，或者其活性片段。
[0012]较好的，上述方法采用抗人的多克隆抗体实现病毒特异性总抗体的检测。
[0013]较好的，采用多种病毒抗原混合液用于血液中总抗体的捕获。
[0014]较好的，所述的多克隆抗体是抗人IgG/A/M多克隆抗体。
[0015]较好的，上述方法所述的多克隆抗体是山羊抗人的抗体。
[0016]较好的，制备两种抗原后，将两者混合。在本专利技术的一个优选实施例中，两种抗原在抗原混合液中的终浓度为1mg/mL。
[0017]所述的胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法中，测试结果判定方法如下：.待测样品与金标抗体反应结果为阳性、但是与新冠病毒抗原反应结果为阴性，则检测样品中不含有新冠病毒抗体；待测样品与金标抗体反应结果为阳性、并且与新冠病毒抗原反应结果为阳性，则检测样品中含有新冠病毒抗体；待测样品与金标抗体反应结果阴阳性，则检测失败或者检测试剂失效。
[0018]另一方面，本专利技术还提供了一种金标抗体偶联物，所述的金标抗体偶联物包括抗人的多克隆抗体和胶体金，胶体金与抗人的多克隆抗体偶联。
[0019]本专利技术还包括含有上述的金标抗体偶联物的检测试剂或者试剂盒。所述的试剂盒中，通常含有说明书、阳性参照和/或阴性参照。
[0020]本专利技术本方法检测线可固定多种具有强抗原性的抗原，增加具有强抗体捕获能力的抗原表位数量，提高新冠抗体的灵敏度与检出率。
[0021]再一方面，本专利技术提供了上述金标抗体偶联物的应用。所述的金标抗体偶联物可以用于识别冠状病毒的抗体，辅助检测冠状病毒，或者制备冠状病毒的检测试剂盒。
[0022]具体而言，针对新型冠状病毒胶体金抗体检测假阴性和灵敏度低的问题，本专利技术提供一种病毒抗体胶体金免疫侧向层析检测方法，该方法包括以下步骤：（1）金标抗体偶联物制备：采用抗人IgG/A/M多克隆抗体，如山羊抗人IgG/A/M多克隆抗体，偶联胶体金，以实现针对抗原的特异性总抗体的检测。
[0023]（2）病毒抗体捕获用抗原混合液制备：多种病毒强抗原性抗原用10mM PBS缓冲液
稀释成抗原混合液，抗原在混合液中的终浓度为1mg/mL，并在硝酸纤维素膜的检测线（T线）处固定。
[0024]该方法用胶体金标记抗人IgG/M/A抗体，工艺简单重复性好，其抗体胶体金标记复合物稳定性优于抗原胶体金偶联复合物。与传统的、用胶体金标记抗原检测线分别固定抗人IgG或IgM抗体方法不同，此方法可固定多种抗原以捕获血清中的抗体，而传统方法受限于抗原性质的多样性，胶体金标记条件不一，一般仅标记一种抗原来捕获抗体。
[0025]本专利技术还提供了相应的胶体金检测试纸。所述的检测试纸主体包括上样垫、结合垫、吸收垫、和反应膜；所述的检测试纸包括金标抗体偶联物，所述的金标抗体偶联物采用抗人的多克隆抗体偶联胶体金；所述的检测试纸还包括病毒抗体捕获用抗原，所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：金标抗体偶联物的制备，采用抗人IgG/M/A的多克隆抗体偶联胶体金；病毒抗体捕获用抗原混合液制备，所述的病毒抗体捕获用抗原包括新型冠状病毒S蛋白、N蛋白、E蛋白或者新型冠状病毒S蛋白、N蛋白、E蛋白的活性片段；将待测样品分别与金标抗体偶联物和病毒抗体捕获用抗原混合液反应；待测样品与新冠病毒抗原反应呈阳性，表明待测样本中含有新冠病毒抗体。2.根据权利要求1所述的胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法，其特征在于，所述的多克隆抗体是抗人IgG多克隆抗体、抗人IgA多克隆抗体或者抗人IgM多克隆抗体种的一种或者几种，获得此抗体的免疫原为人IgG、IgM、和IgA，因此该类抗体与人IgG、IgM、和IgA都有特异性反应。所述的多克隆抗体是抗人IgG多克隆抗体、抗人IgA多克隆抗体或者抗人IgM多克隆抗体种的一种或者几种。3.根据权利要求1所述的胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法，其特征在于，所述的多克隆抗体是山羊抗人的抗体。4.根据权利要求1所述的胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法，其特征在于，所述的抗原在抗原混合液中的终浓度为1mg/mL。5.根据权利要求1-4任意一项所述的胶体金免疫侧向层析检测新型冠状病毒抗体的方法，其特征在于，包括如下步骤：待测样品与金标抗体反应结果为阳性、但是与新冠病毒抗原反应结果为阴性，则检测样品中不含有新冠病毒抗体；待测样品与金标抗体反应结果为阳性、并且与新冠病毒抗原反应结果为阳性，则检测样品中含有新冠病毒抗体；待测样品与金标抗体反应结果阴阳性，则检测失败或者检测试剂失效。金标抗体与C线二...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，田静，梁辉，李雪玲，王侃，刘岩磊，
申请(专利权)人：上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：