新型耐高温arCas12a蛋白在核酸检测方面的应用制造技术

本发明专利技术公开了新型耐高温arCas12a蛋白在核酸检测方面的应用。本发明专利技术研究发现一种在gRNA介导下对靶标序列特异性识别并具有非特异单链DNA切割活性的新型Cas12a蛋白，可作为新型CRISPR/arCas12a系统应用于核酸检测，为基于Cas12a的修饰及分子检测提供了一种新的必要工具选择。同时提供了一种包括arCas12a蛋白和gRNA的新型核酸检测系统和试剂盒，可在25℃

【技术实现步骤摘要】
新型耐高温arCas12a蛋白在核酸检测方面的应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
更具体地，涉及一种新型arCas12a蛋白在核酸检测方面的应用。

技术介绍

[0002]2015年，一种全新的第二类CRISPR-Cas系统-V型系统被发现，该系统中的效应蛋白被命名为Cpf1/Cas12a。张锋团队于2015年11月22日在《Cell》发表的一篇题为“Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas system”的文章。该系统基本的工作流程与CRISPR/Cas9类似，还是借助CRISPR序列的“黑名单”系统对入侵者进行打击。但是gRNA形成的方式与CRISPR/Cas9系统不同：Cpf1/Cas12a蛋白会与未成熟的gRNA复合，并对gRNA进行加工，gRNA则会与PAM附近的互补区域杂交。最后，外源双链DNA（double strand DNA，dsDNA）会被剪切，其基因表达也会被沉默。然而，在切割靶dsDNA的同时，激活了的Cpf1/Cas12a还会降解靶dsDNA邻近的单链DNA（single strand DNA，ssDNA），称之为“附属切割”，这种活性是新开发的核酸检测平台的关键特征。2018年4月27日，Doudna团队和张锋团队同时在《Science》发表了两篇题为“Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection”和“Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6”的论文。表明Cpf1/Cas12a在切割靶dsDNA的同时，还会降解靶dsDNA邻近的ssDNA。这两个独立的实验室分别改造了靶向dsDNA的V型CRISPR系统，使其成为了快速、便宜且高度灵敏的诊断工具。这一发现有望为科学研究以及全球公共卫生带来变革性的影响。利用这种新的CRISPR技术：CRISPR-Cpf1/Cas12a，可以高灵敏度检测包括寨卡病毒感染，登革热病毒感染等在内的疾病，其原理在于将CRISPR-Cpf1/Cas12a与等温核酸扩增结合，检测特异性的RNA或DNA。另外，该系统还包含有一个切割时发出荧光的报告ssDNA。当Cpf1/Cas12a检测到靶标dsDNA序列时，其ssDNase活性就会切割报告ssDNA，释放可检测的荧光信号。将这两种技术结合起来的新系统能够以极低浓度检测RNA和单链DNA分子，具有很好的应用前景。根据张锋团队的研究结果显示，Cpf1/Cas12a蛋白同族间具有较大的差异，某些同族蛋白无活性。目前报道使用较多的lbaCas12a蛋白，其活性温度范围为25-37℃，在高于40℃条件下，lbaCas12a蛋白活性大幅下降，这限制了其与更多其它技术/高温酶的联用，影响了恒温扩增与Cas12a检测一管法的开发及应用。

技术实现思路

[0003]本专利技术涉及一种用于核酸检测的arCas12a蛋白或其功能变体，所述arCas12a蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，所述arCas12a蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
[0004]本专利技术还涉及一种基于CRISPR/Cas12a的核酸检测系统，包括上述的arCas12a蛋白或其功能变体，还包括gRNA。
[0005]本专利技术还涉及基于CRISPR/Cas12a的核酸检测系统的核酸检测方法，其利用上述的arCas12a蛋白或其功能变体、对应靶标序列的gRNA进行CRISPR核酸检测。
[0006]本专利技术还涉及上述arCas12a蛋白或其功能变体的应用，包括：在切割DNA方面的应用；在作为或制备DNA切割工具方面的应用；在核酸检测方面的应用；在基于CRISPR/Cas12a的核酸检测方面的应用；在作为或制备核酸检测工具方面的应用；在作为或制备基于CRISPR/Cas12a的核酸检测工具方面的应用。
[0007]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术研究发现一种在gRNA介导下对靶标序列特异性识别并具有非特异单链DNA切割活性的新型Cas12a蛋白，可作为新型CRISPR/arCas12a系统应用于核酸检测，为基于Cas12a的核酸分子检测提供了一种必要工具的新选择。
[0008]而且基于arCas12a蛋白的核酸检测系统可在25-55℃实现高灵敏、高精度的分子检测，更宽广的活性温度范围将有利于该新型CRISPR/arCas12a系统与其余多种恒温扩增一步法联用方案的开发。同时，该新型CRISPR/arCas12a系统具有很好的特异性和兼容性，检测灵敏度高，且检测成本低廉、操作方便、快捷、应用范围广，在核酸检测方面具有很好的应用前景。
附图说明
[0009]图1为arCas12a蛋白三维结构图。
[0010]图2为arCas12a片段PCR扩增结果。
[0011]图3为arCas12a蛋白表达结果。
[0012]图4为arCas12a蛋白纯化结果。
[0013]图5为arCas12a gRNA纯化结果。
[0014]图6为基于CRISPR/arCas12a的核酸检测结果。
[0015]图7为基于CRISPR/arCas12a 体系配对的gRNA框架序列筛选结果。
[0016]图8为基于CRISPR/arCas12a的核酸灵敏度检测结果。
[0017]图9为基于CRISPR/arCas12a的核酸特异性检测结果。
[0018]图10为胶体金试纸条判断方法示意图。
[0019]图11为基于CRISPR/arCas12a的胶体金试纸条方法核酸灵敏度检测结果。
[0020]图12为基于CRISPR/arCas12a的胶体金试纸条方法核酸特异性检测结果。
[0021]图13为基于CRISPR/arCas12a的检测系统在37-55℃检测结果。
具体实施方式
[0022]以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。对于本领域技术人员来说，其他的任何未背离本专利技术的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本专利技术的保护范围之内。
[0023]除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0024]除非另有说明，本专利技术采用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细
胞生物学、基因组学和重组DNA等是本领域的常规技能。参见萨姆布鲁克( Sambrook )、弗里奇( Fritsch )和马尼亚蒂斯( Maniatis )，《分子克隆：实验室手册》( MOLE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于核酸检测的arCas12a蛋白，其特征在于，所述arCas12a蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，所述arCas12a蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。2.一种基于CRISPR/Cas12a的核酸检测系统，其特征在于，包括权利要求1所述的arCas12a蛋白和gRNA。3.如权利要求2所述的核酸检测系统，其特征在于，所述gRNA包括a）与Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段，以及b）与靶核酸结合的特异性核酸片段，所述与 Cas核酸酶相互作用的框架核酸片段为SEQ ID NO.4~7中至少一种所示。4.如权利要求2所述的核酸检测系统，其特征在于，作为一种可选择的案例，当靶序列如SEQ ID NO.12所示时，gRNA的序列如SEQ ID NO.13所示。5.一种基于权利要求2～4任一所述系统的核酸检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的arCas12a蛋白和对应靶标序列的gRNA进行CRISPR核酸检测。6.一种基于权利要求2～4任一所述系统的核酸检测方法，其特征在于，核酸检测最终结果的获取通过可视化方法实现，所述可视化方法为基于所述arCas12a蛋白附属切割活性的荧光信号检测方式、所述arCas12a蛋白附属切割...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翀，刘华勇，季宇，谢婵芳，黄嘉恩，
申请(专利权)人：广州普世君安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：