新型甲状腺过氧化物酶自身抗体免疫测定制造技术

本文公开了用于检测来自受试者的生物样品中的抗甲状腺过氧化物酶抗体和/或诊断受试者中的甲状腺疾病的免疫测定法。所公开的免疫测定法采用重组食蟹猴甲状腺过氧化物酶(rTPO)且评价抗甲状腺过氧化物酶抗体诱导的包含固体支持物和rTPO的复合物的形成或破坏的水平。的水平。的水平。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型甲状腺过氧化物酶自身抗体免疫测定
[0001]相关申请的交叉引用本申请要求2018年7月2日提交的美国临时申请号62/693,434的优先权，所述申请以其整体通过引用并入本文。


[0002]本文公开了检测来自受试者的生物样品中的抗甲状腺过氧化物酶抗体的方法和诊断所述受试者中的甲状腺疾病的方法。
[0003]背景甲状腺过氧化物酶(TPO)是在甲状腺滤泡细胞的顶膜中发现的膜结合糖蛋白。TPO氧化碘离子，用于添加至甲状腺球蛋白酪氨酸残基上，以产生关键的甲状腺激素T3和T4。TPO也是甲状腺疾病中的自身抗原，所述甲状腺疾病包括例如桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯氏病、萎缩性甲状腺炎、原发性混合瘤(mixedema)和女性中的产后甲状腺炎。抗TPO自身抗体水平升高是甲状腺疾病的危险因素。
[0004]当前用于检测患者抗TPO自身抗体的免疫测定法利用人来源的TPO，其从人尸体甲状腺组织获得。然而，人来源的TPO价格昂贵，难以纯化且产量低，并且批次间可以差异很大。当前的免疫测定法进一步需要多种非人二抗。
[0005]概述本文公开了检测来自受试者的生物样品中的抗甲状腺过氧化物酶抗体的方法。所述方法可以包括将来自所述受试者的生物样品与固体支持物、未标记的重组食蟹猴甲状腺过氧化物酶(rTPO)和标记的食蟹猴rTPO孵育。在所述抗甲状腺过氧化物酶抗体存在的情况下，形成包含所述标记的食蟹猴rTPO、所述未标记的食蟹猴rTPO和所述固体支持物的复合物。所述方法进一步包括检测所述复合物，其存在表明在所述生物样品中存在所述抗甲状腺过氧化物酶抗体。在一些实施方案中，所述方法可以是如本文所述的“抗原桥”测定法。
[0006]还提供了检测来自受试者的生物样品中的抗甲状腺过氧化物酶抗体的方法，所述方法包括将来自所述受试者的生物样品与固体支持物、食蟹猴rTPO和抗人二抗孵育。在所述抗甲状腺过氧化物酶抗体存在的情况下，形成包含所述固体支持物、所述食蟹猴rTPO和所述抗人二抗的复合物。所述方法进一步包括检测所述复合物，其存在表明在所述生物样品中存在所述抗甲状腺过氧化物酶抗体。在一些实施方案中，所述方法可以是如本文所述的“rTPO捕获”测定法。在一些实施方案中，所述方法可以是如本文所述的“IgG类捕获”测定法。
[0007]进一步提供了检测来自受试者的生物样品中的抗甲状腺过氧化物酶抗体的方法，所述方法包括将来自所述受试者的生物样品与固体支持物、未标记的抗TPO抗体、食蟹猴rTPO和标记的抗TPO抗体孵育，和检测所述抗甲状腺过氧化物酶抗体，所述检测包括分析复合物形成的减少，所述复合物包含所述固体支持物、所述未标记的抗TPO抗体、所述食蟹猴rTPO和所述标记的抗TPO抗体。所述生物样品中的抗甲状腺过氧化物酶抗体的存在减少复合物的形成，所述复合物包含所述固体支持物、所述未标记的抗TPO抗体、所述食蟹猴rTPO
和所述标记的抗TPO抗体。复合物的存在与所述生物样品中的抗甲状腺过氧化物酶抗体的存在成反比。在一些实施方案中，所述方法可以是如本文所述的“竞争”测定法或“抑制”测定法。
[0008]本文进一步公开了诊断受试者中的甲状腺疾病的方法。所述方法可以包括将来自所述受试者的生物样品与固体支持物、未标记的重组食蟹猴甲状腺过氧化物酶(rTPO)和标记的食蟹猴rTPO孵育。在所述生物样品中存在抗甲状腺过氧化物酶抗体的情况下，形成包含所述标记的食蟹猴rTPO、所述未标记的食蟹猴rTPO和所述固体支持物的复合物。所述方法进一步包括，如果形成所述复合物，则诊断所述受试者具有所述甲状腺疾病。
[0009]还提供了诊断受试者中的甲状腺疾病的方法，其包括将来自所述受试者的生物样品与固体支持物、食蟹猴rTPO和抗人二抗孵育。在所述生物样品中存在抗甲状腺过氧化物酶抗体的情况下，形成包含所述固体支持物、所述食蟹猴rTPO和所述抗人二抗的复合物。所述方法进一步包括，如果形成所述复合物，则诊断所述受试者具有所述甲状腺疾病。
[0010]进一步提供了诊断受试者中的甲状腺疾病的方法，其包括将来自受试者的生物样品与固体支持物、未标记的抗TPO抗体、食蟹猴rTPO和标记的抗TPO抗体孵育，和如果包含所述固体支持物、所述未标记的抗TPO抗体、所述食蟹猴rTPO和所述标记的抗TPO抗体的复合物的形成减少，则诊断所述受试者具有所述甲状腺疾病。所述生物样品中的抗甲状腺过氧化物酶抗体的存在减少复合物的形成，所述复合物包含所述固体支持物、所述未标记的抗TPO抗体、所述食蟹猴rTPO和所述标记的抗TPO抗体。
[0011]还公开了包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重组产生的甲状腺过氧化物酶(rTPO)，以及编码重组产生的rTPO的cDNA分子。
[0012]本文进一步公开了试剂盒。在一些实施方案中，所述试剂盒包含固体支持物、未标记的食蟹猴rTPO和标记的食蟹猴rTPO。
[0013]或者，所述试剂盒可以包含固体支持物、食蟹猴rTPO和抗人二抗。
[0014]在一些实施方案中，所述试剂盒包含固体支持物、食蟹猴rTPO和抗TPO抗体。
[0015]附图简述当结合附图阅读时，进一步理解概述以及以下详述。为了举例说明公开的方法和试剂盒的目的，在附图中显示所述方法和试剂盒的示例性实施方案；然而，所述方法和试剂盒不限于公开的具体实施方案。在附图中：图1举例说明用于公开的方法(在本文中称为抗原桥免疫测定法)的一个实施方案的示例性反应方案。
[0016]图2举例说明用于公开的方法(在本文中称为IgG类捕获免疫测定法)的一个实施方案的示例性反应方案。
[0017]图3举例说明用于公开的方法(在本文中称为rTPO捕获免疫测定法)的一个实施方案的示例性反应方案。
[0018]图4举例说明用于公开的方法(在本文中称为竞争/抑制免疫测定法)的一个实施方案的示例性反应方案。
[0019]图5举例说明来自示例性rTPO批次间纯度和免疫反应性评价的结果。小图A显示用Gel Code Blue (ThermoFisher 25590)染色的凝胶；小图B显示用小鼠抗TPO单克隆抗体探测、随后用山羊抗小鼠IgG-HRP二抗探测的硝化纤维素膜。使用4-氯-1-萘酚(Sigma)将印迹
显色。
[0020]图6举例说明来自针对4个rTPO抗原批次的示例性rTPO等电点评价的结果。
[0021]图7A和图7B举例说明来自对去糖基化rTPO的免疫测定敏感性的示例性评价的结果。图7A显示rTPO抗原桥测定法，且图7B显示使用各种去糖基化组分构建的人IgG类捕获测定法。“钩比(Hook Ratio)”是指20,000 IU/mL样品的相对光单位(RLU)除以625 IU/mL的最高标准样品的RLU。“BKGD”是指aTPO-阴性血清患者合并物(即，最低标准品)的背景RLU。“S08/S01”是指625 IU/mL的最高标准品的RLU除以最低标准品的RLU。“SP”意指“固相”，且“LR”表示“精简试剂(Lite reagent)”；“de本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.检测来自受试者的生物样品中的抗甲状腺过氧化物酶抗体的方法，所述方法包括：a)将来自所述受试者的所述生物样品与以下孵育：固体支持物，未标记的重组食蟹猴甲状腺过氧化物酶(rTPO)，和标记的食蟹猴rTPO，其中，在所述抗甲状腺过氧化物酶抗体存在的情况下，形成包含所述标记的食蟹猴rTPO、所述未标记的食蟹猴rTPO和所述固体支持物的复合物；和b)检测所述复合物，其存在表明在所述生物样品中存在所述抗甲状腺过氧化物酶抗体。2.权利要求1的方法，其中所述标记物包括酶缀合物、荧光探针、放射性同位素、化学发光化合物、生物发光化合物或其组合。3.权利要求2的方法，其中所述标记物包括吖啶酯(AE)或其类似物。4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述未标记的食蟹猴rTPO间接连接至所述固体支持物。5.权利要求4的方法，其中所述未标记的食蟹猴rTPO是生物素化的，且所述固体支持物包含链霉抗生物素蛋白。6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述未标记的食蟹猴rTPO和所述固体支持物存在于缓冲液中，所述缓冲液包含磷酸盐缓冲液、NaCl、EDTA、普朗尼克F-127、叠氮化钠、山梨糖醇和巯基修饰的牛血清白蛋白。7.检测来自受试者的生物样品中的抗甲状腺过氧化物酶抗体的方法，所述方法包括：a)将来自所述受试者的所述生物样品与以下孵育：固体支持物，食蟹猴rTPO，和抗人二抗，其中，在所述抗甲状腺过氧化物酶抗体存在的情况下，形成包含所述固体支持物、所述食蟹猴rTPO和所述抗人二抗的复合物；和b)检测所述复合物，其存在表明在所述生物样品中存在所述抗甲状腺过氧化物酶抗体。8.权利要求7的方法，其中所述抗人二抗直接或间接连接至所述固体支持物。9.权利要求8的方法，其中所述食蟹猴rTPO包含标记物。10.权利要求9的方法，其中所述标记物包括酶缀合物、荧光探针、放射性同位素、化学发光化合物、生物发光化合物或其组合。11.权利要求10的方法，其中所述标记物是吖啶酯(AE)或其类似物。12.权利要求3或11的方法，其中所述吖啶酯(AE)类似物是DMAE、NSP-DMAE、HQYAE、ZAE、Iso-Di-ZAE、TSP-AE或HEG-GLU-AE。13.权利要求12的方法，其中包含标记物的食蟹猴rTPO是rTPO-NSP-DMAE。14.权利要求13的方法，其中所述rTPO-NSP-DMAE以约50 ng/ml至约2
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g/ml存在。15.权利要求3或11的方法，其中所述食蟹猴rTPO和所述标记物存在于缓冲液中，所述缓冲液包含磷酸盐缓冲液、NaCl、EDTA、普朗尼克F-127、叠氮化钠、山梨糖醇和巯基修饰的
牛血清白蛋白。16.权利要求7的方法，其中所述食蟹猴rTPO直接或间接连接至所述固体支持物。17.权利要求16的方法，其中所述抗人二抗包含标记物。18.权利要求17的方法，其中所述标记物包括酶缀合物、荧光探针、放射性同位素、化学发光化合物、生物发光化合物或其组合。19.权利要求18的方法，其中所述标记物是吖啶酯(AE)或其类似物。20.权利要求19的方法，其中所述吖啶酯类似物是DMAE、NSP-DMAE、HQYAE、ZAE、Iso-Di-ZAE、TSP-AE或HEG-GLU-AE。21.权利要求7-20中任一项的方法，其中所述抗人二抗间接连接至所述固体支持物。22.权利要求21的方法，其中所述抗人二抗是生物素化的，且所述固体支持物包含链霉抗生物素蛋白。23.权利要求7、16、17、18或19中任一项的方法，其中所述食蟹猴rTPO间接连接至所述固体支持物。24.权利要求23的方法，其中所述食蟹猴rTPO是生物素化的，且所述固体支持物包含链霉抗生物素蛋白。25.权利要求23的方法，其中所述食蟹猴rTPO和所述固体支持物存在于缓冲液中，所述缓冲液包含磷酸盐缓冲液、NaCl、EDTA、普朗尼克F-127、叠氮化钠、山梨糖醇和巯基修饰的牛血清白蛋白。26.权利要求7-25中任一项的方法，其中所述抗人二抗包括抗人IgG。27.检测来自受试者的生物样品中的抗甲状腺过氧化物酶抗体的方法，所述方法包括：a)将来自所述受试者的生物样品与固体支持物、未标记的抗TPO抗体、食蟹猴rTPO和标记的抗TPO抗体孵育；和b)检测所述生物样品中的所述抗甲状腺过氧化物酶抗体，所述检测包括分析复合物形成的减少，所述复合物包含所述固体支持物、所述未标记的抗TPO抗体、所述食蟹猴rTPO和所述标记的抗TPO抗体。28.权利要求27的方法，其中所述标记物包括酶缀合物、荧光探针、放射性同位素、化学发光化合物、生物发光化合物或其组合。29.权利要求28的方法，其中所述标记物包括吖啶酯(AE)或其类似物。30.权利要求28的方法，其中所述吖啶酯类似物是DMAE、NSP-DMAE、HQYAE、ZAE、Iso-Di-ZAE、TSP-AE或HEG-GLU-AE。31.权利要求27的方法，其中所述标记的抗TPO抗体是抗TPO IgG HEG-GLU-AE。32.权利要求31的方法，其中所述抗rTPO IgG HEG-GLU-AE以约50 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：美国西门子医学诊断股份有限公司，
类型：发明
国别省市：