一种非特异性扩增天然短片段核酸的方法和试剂盒技术

本发明专利技术涉及一种非特异性扩增天然短片段核酸的方法，包括以下步骤：(1)将天然短片段核酸进行末端修复，获得末端修复的核酸；(2)将所述末端修复的核酸连接双链接头，获得连接产物，其中所述双链接头的每条链仅包含三种碱基；(3)使用具有脱氧尿嘧啶标记的PCR引物对所述连接产物进行PCR扩增，获得PCR产物，其中所述PCR引物与双链接头的一条链完全或部分互补并且仅包含三种碱基；(4)对所述PCR产物先使用具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶进行酶切，再在脱氧核苷酸溶液存在下使用同时具有5

【技术实现步骤摘要】
一种非特异性扩增天然短片段核酸的方法和试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及非特异性扩增天然短片段核酸的方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]天然短片段核酸是在动植物和人体体液中存在的细胞外游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)，其长度一般小于500bp。在凋亡的过程中，人体细胞内DNA发生断裂并被分泌至细胞外，从而形成cfDNA。目前，肿瘤和产前诊断研究已经证实了cfDNA作为标记物的用途。然而，一方面，cfDNA在体液中的含量非常低，例如在血浆中的含量甚至低于10ng/mL，且在提取过程中容易损失、提取难度大。另一方面，cfDNA在液体活检和无创产前筛查中的用量较大。这使得直接提取的天然短片段核酸在含量和质量上难以满足其作为试验品、标准品、质控品和参考品的要求。
[0003]目前有些方法通过超声处理长片段DNA来获得与天然短片段核酸大小相似的DNA片段。然而，如此获得的DNA片段与天然短片段核酸存在本质区别，例如大小分布不同。此外，有的方法还通过酶切消化来获得短片段DNA。然而，酶切产物的长度分布也与天然短片段核酸显著不同，并且受限于酶切位点，酶切产物一般很难达到天然短片段核酸的大小(例如，血浆cfDNA平均长度仅为约170bp)，其末端也不如天然短片段核酸多变。因此，超声处理和酶切消化的DNA片段都无法代替天然短片段核酸作为试验品、标准品、质控品和参考品。
[0004]因此，需要一种能够获得大量天然短片段核酸的方法，以解决针对此类DNA进行研究以及检测的问题。<br/>
技术实现思路

[0005]针对上述需求，本专利技术提供了一种非特异性扩增天然短片段核酸的方法，该方法以天然短片段核酸为原始材料，通过使用特别设计的接头和引物对其进行有效的扩增，以获得大量与天然短片段核酸在DNA序列和片段长度分布上都基本相同的DNA片段。本专利技术还提供用于非特异性扩增天然短片段核酸的试剂盒。
[0006]本专利技术的基本原理是：在天然短片段核酸两端连接上每条链仅含三种碱基的双链接头，再利用PCR技术和具有脱氧尿嘧啶标记的引物对加接头的DNA片段进行扩增，然后先后使用具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶及同时具有5
’→3’
聚合酶活性和3
’→5’
外切酶活性的酶对PCR扩增产物进行酶切，以完全去除引入的接头序列，从而获得大量与天然短片段核酸在DNA序列和片段长度分布上都基本相同的DNA片段。
[0007]因此，在第一个方面，本专利技术提供一种非特异性扩增天然短片段核酸的方法，包括以下步骤：
[0008](1)将天然短片段核酸进行末端修复，获得末端修复的核酸；
[0009](2)将所述末端修复的核酸连接双链接头，获得连接产物，其中所述双链接头的每条链仅包含三种碱基；
[0010](3)使用具有脱氧尿嘧啶标记的PCR引物对所述连接产物进行PCR扩增，获得PCR产物，其中所述PCR引物与双链接头的一条链完全或部分互补并且仅包含三种碱基；
[0011](4)对所述PCR产物先使用具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶进行酶切，再在脱氧核苷酸溶液存在下使用同时具有5
’→3’
聚合酶活性和3
’→5’
外切酶活性的酶进行酶切，获得天然短片段核酸的非特异性扩增产物，所述脱氧核苷酸溶液仅包含PCR引物所缺乏碱基的互补碱基。
[0012]在一个实施方案中，天然短片段核酸是小于500bp的双链DNA。
[0013]在一个实施方案中，天然短片段核酸的来源包括但不仅限于血液、血清、血浆、关节液、精液、尿液、汗液、唾液、粪便、脑脊液、腹水、胸水、胆汁、胰腺液等。优选地，天然短片段核酸来自血浆、血液、或尿液。
[0014]在一个实施方案中，末端修复采用一种或多种选自以下的酶：T4DNA聚合酶、Klenow酶、T4多核苷酸激酶和Klenow Fragment酶。其他本领域熟知的可用于末端修复的酶也适用于本专利技术。
[0015]在一个实施方案中，该方法还包括在连接接头前，将末端修复的核酸进行3
’
端悬A的步骤。在该实施方案中，末端修复和3
’
端悬A可以在两个反应体系中进行，即，在末端修复后，需经过纯化再进行3
’
端悬A。可替换地且为优选地，末端修复和3
’
端悬A在一个反应体系中进行，即，在末端修复和3
’
端悬A同时完成，之后再对核酸进行纯化。或者，更加优选地，末端修复、3
’
端悬A和连接接头三者在一个反应体系中进行，连接反应之后再对核酸进行纯化，以进行PCR扩增。在该实施方案中，3
’
端悬A可以采用klenow ex-酶、或Taq酶、或klenow ex-酶与Taq酶的组合。其他本领域熟知的可用于3
’
端悬A的酶也适用于本专利技术。
[0016]在一个实施方案中，形成双链接头的每条链仅包含任意三种碱基，例如，仅包含A/C/T、A/C/G、C/T/G或A/T/G。每条链包含的碱基组合可互不相同，例如一条链包含A/C/T，另一条链包含A/C/G。优选地，双链接头的两条链完全或部分反向互补。在一个实施方案中，形成双链接头的其中一条链的5
’
末端带有磷酸基团。更优选地，在形成双链接头的两条链中，一条链的3
’
末端为脱氧尿嘧啶U，另一条链的5
’
末端带有磷酸基团。在这种情况下，双链接头中含有的脱氧尿嘧啶有利于切除与作为模板的天然短片段核酸所连接的接头，从而提高非特异性扩增的产量；换言之，这种情况下获得的最终产物里仍然包含作为模板的天然短片段核酸拷贝。
[0017]例如，接头是由以下SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的单链DNA退火形成：
[0018]SEQ ID NO:1：5
’-
TGGTTTTGCCTGTCGTGTTGTCTCGTGCTCTTCU-3
’
[0019]SEQ ID NO:2：5
’-
GAAGAGCACGAGAAGGAGAAGAGCAACGGCAAG-3
’
[0020]在一个实施方案中，接头连接通过T4 DNA连接酶和/或T7 DNA连接酶来进行。
[0021]在一个实施方案中，与双链接头的一条链完全或部分互补的PCR扩增引物具有脱氧尿嘧啶标记，并且仅包含三个碱基。引物中含有的脱氧尿嘧啶标记使得之后用具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶进行酶切时，可以在引物和目标核酸之间形成单碱基的缺口，从而完全去除引物序列。例如，所述引物具有以下序列：
[0022]SEQ ID NO:3：5
’-
CTTGCCGTTGCTCTTCTCCTTCTCGTGCTCTTCU-3
’
[0023]SEQ ID NO:4：5
’-
GGTTTTGCCTGTCGTGTTGTCTCGTGCTCTTCU-3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非特异性扩增天然短片段核酸的方法，包括以下步骤：(1)将天然短片段核酸进行末端修复，获得末端修复的核酸；(2)将所述末端修复的核酸连接双链接头，获得连接产物，其中所述双链接头的每条链仅包含三种碱基；(3)使用具有脱氧尿嘧啶标记的PCR引物对所述连接产物进行PCR扩增，获得PCR产物，其中所述PCR引物与双链接头的一条链完全或部分互补并且仅包含三种碱基；(4)对所述PCR产物先使用具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶进行酶切，再在脱氧核苷酸溶液存在下使用同时具有5
’→3’
聚合酶活性和3
’→5’
外切酶活性的酶进行酶切，获得天然短片段核酸的非特异性扩增产物；所述脱氧核苷酸溶液仅包含PCR引物所缺乏碱基的互补碱基。2.权利要求1所述的方法，其中所述天然短片段核酸是小于500bp的双链DNA。3.权利要求1所述的方法，其中所述天然短片段核酸的来源选自血液、血清、血浆、关节液、精液、尿液、汗液、唾液、粪便、脑脊液、腹水、胸水、胆汁和胰腺液。4.权利要求3所述的方法，其中所述天然短片段核酸来自血浆、血液或尿液。5.权利要求1所述的方法，其中所述末端修复采用一种或多种选自以下的酶：T4 DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶、Klenow Fragment酶和Klenow酶。6.权利要求1所述的方法，其中该方法还包括在连接接头前，将末端修复的核酸进行3
’
端悬A的步骤。7.权利要求6所述的方法，其中所述末端修复和3
’
端悬A在一个反应体系中进行。8.权利要求6所述的方法，其中所述末端修复、3
’
端悬A和连接接头三者在一个反应体系中进行。9.权利要求6-8任一项所述的方法，其中所述3
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端悬A采用klenow ex-酶、或Taq酶、或klenow ex-酶与Taq酶的组合。10.权利要求1所述的方法，其中所述双链接头的两条链完全或部分反向互补。11.权利要求1所述的方法，其中一条链的3
’
末端为脱氧尿嘧啶。12.权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中的连接通过T4 DNA连接酶和/或T7 DNA连接酶来进行。13.权利要求1所述的方法，其中所述具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶选自：USER
TM
酶，以及包含Endonuclease VIII和UDG的混合物。14.权利要求1所述的方法，其中所述同时具...

【专利技术属性】
技术研发人员：田婕，吴娜拉胡，杨雪艳，张扬，张建光，
申请(专利权)人：北京贝瑞和康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：