固定化酶载体的修饰方法及应用技术

本申请提供了固定化酶载体的修饰方法，包括以下步骤：使固定化酶载体，优选多孔无机材料，与醇溶蛋白接触。本申请还提供了修饰的固定化酶载体及其用途，制备固定化酶组合物的方法，以及固定化酶组合物及其用途。以及固定化酶组合物及其用途。

【技术实现步骤摘要】
固定化酶载体的修饰方法及应用


[0001]本申请属于酶工程领域。具体而言，本申请涉及固定化酶载体的修饰方法以及固定化酶载体及其用途。在更具体的方面，本申请提供了固定化酶组合物的制备方法，以及通过所述方法制备的固定化酶组合物及其用途。

技术介绍

[0002]生物酶是具有催化功能的蛋白质，它是从生物体中产生的，具有特殊的催化功能，因此生物酶的制造和应用领域逐渐扩大。其中，脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)，亦称三酰基甘油酰基水解酶，是重要的工业酶制剂品种之一，其可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，被广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。目前，脂肪酶大规模工业应用的难点主要是酶液价格昂贵，使用成本高。酶固定化是解决这个难点的有效方法之一，它将生物酶限域到载体材料上，使得生物酶不溶于反应介质，从而达到生物酶回收和循环利用的目的。目前，充当固定化酶载体的材料主要有两类，一类是离子交换树脂等颗粒性载体，一类是白炭黑、活性炭、硅藻土等粉末类多孔吸附质材料。与树脂类载体相比，白炭黑等多孔吸附质材料因其巨大的比表面积，高的孔体积，优良的机械稳定性和低廉的价格等优点，而受到广泛关注，被用于粉末类固定化酶优良载体的开发。可以通过物理吸附的方法将生物酶固定到此类吸附质材料上，但酶与载体分子的相互作用力不强，容易导致酶的固定化效率及稳定性下降。
[0003]对载体材料进行表面改性是提高固定化酶催化性能的一种有效方法。目前对白炭黑等氧化硅材料进行改性的方法主要是利用硅烷偶联剂或者功能化聚硅氧烷跟二氧化硅表面的硅羟基反应。例如Mesa课题组(Claudia Bernal,Juan C.Poveda-Jaramillo,Monica Mesa,Raising the enzymatic performance of lipase and protease in the synthesis of sugar fatty acid esters,by combined ionic exchange-hydrophobic immobilization process on aminopropyl silica support.Chemical Engineering Journal,2018,334,760-767)利用3-氨丙基三乙氧基硅烷或者3-氨丙基三甲氧基硅烷对氧化硅进行改性，并用于脂肪酶固定化，所得固定化酶在蔗糖脂肪酸酯合成反应中表现出好的催化活性。这种改性方法硅烷偶联剂用量大，利用率低，且功能基团嫁接密度小，操作复杂，材料改性成本较高。中国专利申请CN 104087571A描述了一种利用含氢硅油对二氧化硅进行改性，并利用改性二氧化硅做载体固定化脂肪酶的方法，该方法所使用的含氢硅油改性剂和催化剂价格昂贵，改性步骤繁琐，处理成本高。
[0004]除小分子外，利用大量蛋白分子对载体进行填充包附是改善固定化酶性能的另一种方式。例如美国专利US5232843A利用非脂肪酶对疏水型氧化硅类载体或者离子交换树脂载体的固定化酶进行填充包附，使固定化酶表现出高于未经非脂肪酶蛋白填充固定化酶的催化活性，该方法主要使用水溶性非脂肪酶蛋白对固定化酶进行包附填充，且所包附固定化酶载体必须经过硅脂疏水改性或者包含离子交换基团，对普通的亲水型多孔材料固载酶未能表现出明显的改善酶活效果。
10wt.％。
[0027]在第五方面的一些实施方案中，所述固定化酶组合物中，所述多羟基化合物的含量为0wt.％-50wt.％。
[0028]在第五方面的一些实施方案中，所述固定化酶组合物中，所述固定化酶载体的含量为40wt.％-95wt.％。
[0029]在第五方面的一些实施方案中，所述固定化酶组合物中，所述醇溶蛋白的含量为1wt.％-5wt.％。
[0030]在上述任一方面所述的实施方案中，所述多孔无机材料为气相二氧化硅、水合硅胶、沉淀二氧化硅(也被称为白炭黑)、硅胶或硅藻土。
[0031]在上述任一方面所述的实施方案中，所述醇溶蛋白为玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白、糯米醇溶蛋白、高粱醇溶蛋白或椰肉醇溶蛋白。
[0032]在上述任一方面所述的实施方案中，所述酶为来自动物、植物或微生物的脂肪酶。
[0033]在上述任一方面所述的实施方案中，所述脂肪酶来自选自以下的微生物：疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、米根霉(Rhizopus oryzae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、黑曲霉(Aspergillus niger)或以上微生物的基因改造菌种。
[0034]在上述任一方面所述的实施方案中，所述多羟基化合物为多糖类化合物。
[0035]第六方面，本申请提供了根据第四方面所述的方法制备的固定化酶组合物、或第五方面所述的固定化酶组合物在制备母乳脂肪替代物中的用途。
附图说明
[0036]图1为白炭黑压片的水接触角照片。
[0037]图2为使用0.5％(w/v)的醇溶蛋白一次修饰的白炭黑压片的水接触角照片。
[0038]图3为使用0.5％(w/v)的醇溶蛋白三次修饰的白炭黑压片的水接触角照片。
[0039]专利技术详细描述
[0040]使用非水溶性的醇溶蛋白对固定化酶载体进行修饰得到的修饰的固定化酶载体能够有效地提高酶活稳定性和催化专一性。虽然多孔无机材料具有大的表面积和高的孔体积，可以通过物理吸附的方法将生物酶吸附到多孔无机材料上，但是其与生物酶的相互作用力不强，容易导致生物酶的固定化效率及稳定性下降。本申请的专利技术人通过研究开发出新的固定化酶载体的修饰方法以及将修饰的固定化酶载体用于制备固定化酶组合物。使用本申请的固定化酶载体制备的固定化酶组合物具有以下一种或多种优势：
[0041]1.固定化酶组合物具有提高的酶催化专一性，尤其是Sn-1,3专一性；
[0042]2.固定化酶组合物具有良好的循环稳定性；
[0043]3.使用本申请的固定化酶制备的母乳脂肪替代物品质优良。
[0044]定义
[0045]提供以下定义用以更好地说明本申请的内容以及在实践本申请的各项专利技术中指导本领域普通技术人员。除非另外说明，本申请中的术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同，例如，涉及原料和产物、操作步骤、工艺参数、使用设备和工具以及数值单位中的术语。本文所引用的所有专利文献、学术论文及其他公开出版物，其中的全部内容整体
并入本文作为参考。
[0046]如本文所用术语“多孔无机材料”是指具有微小细孔、质轻、表面积很大的各种天然或人工无机非金属材料。例如，多孔无机材料包括但不限于气相二氧化硅、水合硅胶、沉淀二氧化硅、硅胶、硅藻土等。
[0047]如本文所用术语“醇溶蛋白”是植物种子储存蛋白的组分之一，它包含大量非极性氨基酸，不溶于水，具有强的耐水性、亲油性和成膜性，在食品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.固定化酶载体的修饰方法，其包括以下步骤：使固定化酶载体，优选多孔无机材料，与醇溶蛋白接触；优选地，所述接触步骤包括将包含醇溶蛋白与固定化酶载体的混合物进行静置、振荡或搅拌处理，或者将醇溶蛋白溶液循环通过所述固定化酶载体，得到处理后的混合物，并干燥所述处理后的混合物。2.如权利要求1所述的方法，其中所述醇溶蛋白溶解于60％-95％(v/v)的醇类水溶液或丙酮中，优选地，所述醇溶蛋白溶解于70％(v/v)的丙酮或95％(v/v)的乙醇中；和/或所述醇溶蛋白的质量浓度为0.01％-2％(w/v)，优选为0.1％-1％(w/v)，更优选为0.5％(w/v)；和/或所述醇溶蛋白与所述固定化酶载体的质量比为1:2-1:100，优选为1:40-1:60，更优选为1:40、1:50或1:60；和/或所述处理的时间为10min-6h，优选为1-3h，更优选为1h或3h；和/或所述干燥为旋转蒸发、真空干燥、冷冻干燥、烘箱干燥或自然干燥，优选为旋转蒸发；和/或所述接触步骤的次数为1-10次，优选为1-3次，更优选为1次或3次。3.固定化酶载体，其包含醇溶蛋白。4.根据权利要求1或2所述的方法制备的修饰的固定化酶载体、或权利要求3所述的固定化酶载体在制备固定化酶组合物中的用途。5.固定化酶组合物的制备方法，其包括将根据权利要求1或2所述方法制备的修饰的固定化酶载体或权利要求3所述的固定化酶载体与待固定的酶接触的步骤，并且任选地包括将根据权利要求1或2所述方法制备的修饰的固定化酶载体或权利要求3所述的固定化酶载体、待固定的酶和多羟基化合物接触的步骤；优选地，所述接触步骤包括将包含根据权利要求1或2所述方法制备的修饰的固定化酶载体或权利要求3所述的固定化酶载体与待固定的酶的混合物进行振荡处理，任选地将包含根据权利要求1或2所述方法制备的修饰的固定化酶载体或权利要求3所述的固定化酶载体、待固定的酶和多羟基化合物的混合物进行振荡处理，得到振荡处理后的混合物，干燥所述振荡处理后的混合物。6.如权利要求5所述的方法，其中所述酶的质量浓度为1-30mg/mL，优选为2.5-25mg/mL，更优选为2.5mg/mL、10mg/mL或25mg/mL；和/或所述振荡处理的时间为0.5h-48h，优选为1h-5h，更优选为4h；和/或所述振荡处理的温度为4℃-25℃，优选为20-25℃，更优选为25℃；和/或所述干燥为喷雾干燥、真空干燥或冷冻干燥。7.固定化酶组合物，其包含根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：金倩茹，辛本荣，郑妍，
申请(专利权)人：丰益上海生物技术研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：