无血清培养基制备脂肪间充质干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及无血清培养基制备脂肪间充质干细胞的方法。具体涉及无血清分离培养原代脂肪间充质干细胞的方法，包括如下步骤：处理脂肪样本；离心获取上层脂肪组织，用D

【技术实现步骤摘要】
无血清培养基制备脂肪间充质干细胞的方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种从脂肪中分离脂肪间充质干细胞的方法。本专利技术还涉及上述脂肪间充质干细胞培养中所用的培养基及相关试液。使用本专利技术方法分离培养所述脂肪间充质干细胞时，能够呈现本专利技术所述优异技术效果。特别是，本专利技术涉及使用无血清的培养基从脂肪中分离培养间充质干细胞的方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan AI.Mesenchymal stem cells.J Orthop Res.1991,9:641-650.Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。
[0003]干细胞是人体细胞的祖先，我们体内的所有细胞均来自于干细胞。当体内的细胞衰老死亡或者损伤变性时，干细胞就会生长和转变出可以替代它们的细胞。作为种子细胞，临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。人间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。最初的临床研究是1995年由Lazarus等人进行的，他们收集缓解期血液肿瘤患者的自体MSC，在体外扩增培养4～7周，然后再静脉注射入患者体内，患者被分为3组，分别给予不同剂量的MSC，注射后没有观察到毒副作用，提示MSC用于移植治疗安全可靠。随后自体MSC的临床报道逐渐增多，病种涉及放疗及化疗后造血重建、移植物抗宿主病(GVHD)、心脏系统疾病等，在这些报道中均证明临床经静脉输注安全可靠。
[0004]间充质干细胞的分离培养以及传代培养工艺是关系到干细胞作为治疗药物使用安全性的关键步骤。培养工艺中尤其是培养基的成分是主要的影响参数。在已有的文献记载的方法中，对间充质干细胞进行分离培养和传代培养时，所用的培养基多需要添加血清，例如胎牛血清，特别是通常需要添加10％胎牛血清，例如通常采用MSC完全培养基(其为包含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基)对间充质干细胞进行分离和培养传代。
[0005]然而，一方面，胎牛血清的成本相当高，这对于间充质干细胞的培养是不利的；另
一方面，胎牛血清作为一种动物来源的外源性物质，其存在于干细胞中会对细胞的临床使用的安全性产生潜在风险。因此，无血清的分离和传代培养间充质干细胞是有意义的。
[0006]此外，人们已经从脂肪组织分离出一类具有多向分化潜能的干细胞，并在体外培养特殊体系中成功地分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞与肌细胞等，这种可分化的干细胞被认可为脂肪来源的间充质细胞，即脂肪干细胞或脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，脂肪干细胞具有分化多胚层全能性特征，其中包括中胚层，内胚层和外胚层分化细胞的能力，能分泌许多潜在的有利的生长因子和细胞活素以细胞为基础的促进创面愈合的治疗方法快速发展。脂肪源性干细胞是一群多功能间充质干细胞，可以分化为其他的细胞系在脂肪组织的非脂肪(间质)碎片中存在大量的脂肪源性细胞，且易于分离获取。
[0007]作为各种组织缺损的辅助治疗方法，脂肪源性干细胞被推荐应用。在创面愈合过程中，血管再生是一个重要的步骤新生血管的形成是支持肉芽组织形成和角化细胞存活扩增愈合创伤的的必要条件。因此认为，脂肪源性干细胞是通过快速促血管再生从而促进创面的愈合。另外，脂肪源性干细胞还显示出通过细胞分化以及分泌促进胶原合成和真皮成纤维细胞迁移的长因子来促进创面的愈合。
[0008]人们已将脂肪源性干细胞与细胞外基质支架成分联合应用于动物的皮肤软组织创面，发现脂肪源性干细胞以促进支架的血管化能力。有研究结果显示，脂肪源性细胞对创面愈合的促进作用与脂肪源性干细胞促进上皮化和肉芽组织的形成有关，并且脂肪源性干细胞有潜在的表皮细胞分化能力研究结果还提示脂肪源性干细胞的远位分化能力是多功能脂肪干细胞对创面的微环境的一个反应。脂肪源性干细胞对局部血管的重塑包括直接分化为血管内皮细胞和分泌血管生长因子，后两者则有益于血管的再生。即是说，脂肪源性干细胞通过细胞分化和血管再生促进创面的愈合。另外，人们将脂肪源性干细胞与血小板源性生长因子，即一种众所周知的参与正常创面愈合过程的因子，联合用于创面的治疗。研究结果显示二者的联合应用有协同作用，即可能通过提高生长因子的水平而促进了创面的愈合。
[0009]理论上讲，细胞疗法前景广阔，因为多功能干细胞或祖细胞通过对创面缺失组织的再生和持续提供许多有利因子而促进创面的愈合。尽管如此，关于脂肪源性干细胞对创面愈合的机制的研究仍有待于进一步探索。脂肪源性干细胞对局部血管的重塑包括直接分化为血管内皮细胞和分泌生血管生长因子，后两者则有益于血管的再生。
[0010]脂肪间充质干细胞的应用前景已通过在各疾病动物模型上的应用得以验证，其用来干预治疗糖尿病、肝脏损伤修复、膀肌重建、2型糖尿病阳疹、心肌梗死、脑梗、认知功能障碍、中风、椎间盘修复、胶质母细胞瘤治疗、骨缺损、创伤后血管新生、风湿性关节炎、唇愕裂、心力衰竭、结肠炎、尿失禁等。有研究者将脂肪间充质干细胞转变为心肌细胞，既重新编程了成熟的干细胞，又能改善心脏病的治疗。也有人将脂肪间充质干细胞与纤维蛋白胶复合后注射到心肌梗塞大鼠的左心室壁上，ADSCs在临床组织工程治疗心肌梗塞上会有很大的前景。脂肪间充质干细胞作为种子细胞放于网状支架中，成功地修复了狗的颅骨损伤，为临床治疗颅骨损伤。还有研究应用心脏病人腹部脂肪的脂肪间充质干细胞注射进他们的心脏以后，减少了心脏的损伤、同时也增加了血流，干细胞注射进心脏以后经过6个月，病人心脏接受带氧血液的能力提高，心脏左心室送出的血液也增加了3.5倍，SPELT显像证明接受
脂肪间充质干细胞注射的病人心泵的能力增加了5.7％，核磁扫描也显示患者本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分离培养原代脂肪间充质干细胞的方法，包括如下步骤：(1)在生物安全柜中处理经2-8℃冷链运输至实验室的脂肪样本；(2)使脂肪样本离心，移取上层脂肪组织，再使用D-Hanks液清洗一遍，再次离心，移取脂肪组织，加入1％Ⅱ型胶原酶振荡消化；(3)消化结束后，加一倍体积D-hanks液稀释，离心，留取底层的细胞沉淀进行接下来的操作；(4)取步骤(3)所得细胞沉淀，加入原代完全培养基重悬，取样计数，按照规定细胞量接种至培养瓶；置CO2培养箱中培养；(5)培养3d后培养基全换液一次，至细胞融合度达80％以上后，去旧培养基，用D-hanks液清洗细胞，加入重组胰酶溶液消化细胞，使细胞脱落，加入D-hanks液稀释，离心，将细胞沉淀用原代完全培养基重悬，即得原代脂肪间充质干细胞。2.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，两次离心均以100xg离心5min的条件进行操作；和/或，步骤(2)中，加入2倍体积的1％Ⅱ型胶原酶振荡消化30min。3.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中，离心以100xg离心5min的条件进行操作。4.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中，按照规定细胞量接种至培养瓶是指按照细胞量1～5
×
104/cm2接种至T75瓶，例如是指指按照细胞量2
×
104/cm2接种至T75瓶；和/或，步骤(4)中，CO2培养箱中培养的条件为：5％CO2，37℃，饱和湿度。5.根据权利要求1的方法，其中步骤(5)中每瓶加2ml重组胰酶溶液消化细胞2min；和/或，步骤(5)中以100xg离心10min；和/或，步骤(5)中每瓶加入10ml的D-hanks液稀释。6.根据权利要求1的方法，其中所述D-Hanks液的配方组成如下：8.0g的NaCl、0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.08g的Na2HPO4.12H2O、0.35g的NaHCO3、水至1000ml；例如，其配制方法如下：将各物料用1000ml溶解，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，即得。7.根据权利要求1的方法，其中所述原代完全培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFGF。8.根据权利要求1的方法，其中所述原代增补培养基是以DMEM-F12培养基为基质配制并包含：1％血小板裂解物、1％人血白蛋白、2μg/ml重组胰岛素、15ng/ml的EGF、25ng/ml的bFG...

【专利技术属性】
技术研发人员：王正，肖海蓉，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：