用于检测免疫抗氧化基因基因多态性的探针、引物、试剂盒制造技术

本发明专利技术针对免疫抗氧化基因的不同多态性，设计4组特异性引物和探针组合，探针的序列如SEQ ID NO.:1、4、7、10所示。本发明专利技术的用于免疫抗氧化基因位点的不同多态性的探针和引物，在检测免疫抗氧化基因多态性时，具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量检测等优点。高通量检测等优点。高通量检测等优点。

【技术实现步骤摘要】
用于检测免疫抗氧化基因基因多态性的探针、引物、试剂盒


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体的说涉及用于检测免疫抗氧化基因基因多态性的探针、引物、试剂盒。

技术介绍

[0002]疾病的两大根源—抗氧化与免疫力，与癌症的有很大的关联；机体的免疫抗氧化功能与基因多态性有关。
[0003]肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)是一种涉及到系统性炎症的细胞因子，主要由巨噬细胞分泌。其主要功能是调节免疫细胞，作为一种内源性致热源，可以导致发热，引起细胞凋亡，阻止肿瘤发生和病毒复制等，在炎症和免疫反应中起着重要的作用。基因变异可导致体内的免疫细胞活性调节能力受损，特异性免疫功能过强，容易导致炎症反应发生，造成强直性脊柱炎等多种炎症发病风险性疾病易感性增高。
[0004]细胞毒T淋巴细胞抗原4基因(CTLA4)是免疫球蛋白超家族的成员，CTLA-4蛋白由CTLA-4基因编码，CTLA-4与其配体结合后抑制T细胞激活，使肿瘤细胞免受T淋巴细胞攻击。基因变异导致CTLA4蛋白与B7蛋白分子的结合力下降，使得CTLA4蛋白对免疫信号的下调作用降低，破坏了正常的免疫信号调节，产生1型糖尿病等免疫性疾病。
[0005]白细胞介素-3(interleukin-3，IL-3)，又叫多集落刺激因子(multi-CSF)，是白细胞介素家族重要成员之一，主要由激活了的T细胞、巨噬细胞和骨髓基质干细胞产生，通过与其受体—IL-3R结合，在机体的造血调节和免疫调节中发挥重要作用。该基因不但与骨髓功能衰竭等造血细胞疾病相关，而且与多种炎症也相关，如类风湿性关节炎、青少年型皮肤炎等，甚至与精神分裂症也有关系。细基因多态性可能影响个体对炎症的反应，进而影响相关疾病的遗传易感性。
[0006]锰超氧化物歧化酶基因(SOD-2)编码锰超氧化物歧化酶(MnSOD)，是体内主要的超氧自由基清除剂，保护细胞免受ROS的损伤。基因变异导致超氧化物歧化酶活性下降，机体抗氧化能力不足，自由基在体内累积，从而影响健康。
[0007]针对上述基因多态性检测可作为机体免疫抗氧化功能的评估指标，具有较重要的意义。目前普遍应用的突变检测方法为DNA直接测序法，PCR产物直接进行DNA序列分析，可以明确突变位点，但存在费时费力，成本较昂贵，不适用于对大量样本进行检测等缺点。因此，需要开发一种适合大批量样本检测的方法。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的首先在于提供用于检测免疫抗氧化基因基因多态性的探针，该探针的序列如SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:7、或SEQ ID NO.:10所示；
[0009]所述的免疫抗氧化基因为TNF-α、CTLA4、IL3、SOD-2基因；
[0010]所述的探针两端可以加基团修饰，
[0011]其中修饰基团为：5
′
的修饰基团为荧光基团，如FAM、HEX、ROX、CY5；3
′
的修饰基团
为淬灭基团，如BHQ1、BHQ2；
[0012]具体的说，本专利技术提供的用于检测TNF-α(rs1799724)基因多态性的探针为：SEQID NO.:1 5
′-
FAM-CATGGGGACCCCCCCTTAANGAAGACAGGGCCATG-BHQ1-3
′
；
[0013]其中N为变异碱基，具体为C>T；
[0014]所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～30bp(5
′-
GGACCCCCCCTTAANGAAGACAGGG-3
′
)，其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为(5
′-
CATGG
……
CCATG-3
′
)。
[0015]本专利技术提供的用于检测CTLA4(rs231775)基因多态性的探针为：SEQ ID NO.:45
′-
HEX-CTCAGCTGAACCTGGCTNCCAGGACCTGGCCCTGAG-BHQ1-3
′
；
[0016]其中N为变异碱基，具体为A>G；
[0017]所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～31bp(5
′-
CTGAACCTGGCTNCCAGGACCTGGCC-3
′
)，其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为(5
′-
CTCAG
……
CTGAG-3)。
[0018]本专利技术提供的用于检测IL3(rs31480)基因多态性的探针为：SEQ ID NO.:75
′-
ROX-CCAAGGCGGGAGGNTGTTGCCAACTCTTGG-BHQ2-3
′
；
[0019]其中N为变异碱基，具体为C>T；
[0020]所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～25bp(5
′-
GCGGGAGGNTGTTGCCAACT-3
′
)，其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为(5
′-
CCAAG
……
CTTGG-3
′
)。
[0021]本专利技术提供的用于检测SOD-2(rs4880)基因多态性的探针为：SEQ ID NO.:105
′-
CY5-CTGGCTCCGGNTTTGGGGTATCTGGGCCAG-BHQ2-3
′
；
[0022]其中N为变异碱基，具体为T>C；
[0023]所述的探针包括环序列和茎序列，其中环序列为第6～25bp(5
′-
TCCGGNTTTGGGGTATCTGG-3
′
)，其两侧是两个反向互补的茎序列，茎序列为(5
′-
CTGGC
……
GCCAG-3
′
)。
[0024]探针的设计原理为：根据TNF-α、CTLA4、IL3、SOD-2分别设计探针和引物，需要保证在退火温度下DNA模板不存在时，探针呈茎环状态。探针所采用的淬灭基团为BHQ1或BHQ2，其淬灭空间范围很小，搭配短发射波长的荧光基团，如HEX，只有当分子信标呈茎环结构时，荧光才会被很好地淬灭。环序列与靶DNA序列互补时，确定最佳PCR引物为40-45bp大小，PCR产物长度设计在130-180bp。
[0025]本专利技术还提供了用于检测免疫抗氧化基因基因多态性的引物，该引物的序列如SEQID NO.:2和3、SEQ ID NO.:5和6、SEQ ID NO.:8和9、SEQ ID NO.:11和12，具体序列如下：
[0026]TNF-α(rs1799724)
[0027]SEQ ID NO.:2 5
′-...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测免疫抗氧化基因多态性的探针，其特征在于该探针的序列如SEQ ID NO.:1、SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:7、或SEQ ID NO.:10所示。2.根据权利要求1所述的探针，其中所述的免疫抗氧化基因为TNF-α、CTLA4、IL-3或SOD-2。3.根据权利要求1所述的探针，其特征在于其中SEQ ID NO.:1的修饰基团为：5
′
的修饰基团为荧光基团FAM，3
′
的修饰基团为淬灭基团BHQ1；SEQ ID NO.:4的修饰基团为：5
′
的修饰基团为荧光基团HEX，3
′
的修饰基团为淬灭基团BHQ1；SEQ ID NO.:7的修饰基团为：5
′
的修饰基团为荧光基团ROX，3
′
的修饰基团为淬灭基团BHQ2；SEQ ID NO.:10的修饰基团为：5
′
的修饰基团为荧光基团CY5，3
′...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅咏南，黄芬芬，毛丹丹，张奕，
申请(专利权)人：上海利康精准医疗技术有限公司，
类型：发明
国别省市：