糖基转移酶变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及糖基转移酶变体及其应用。本发明专利技术对来源于Bacillus菌属的环糊精糖基转移酶野生型基因进行定向进化，获得了提高糖苷基团转移催化能力的突变体。突变的氨基酸序列位置有R45H、K229R、F256V、V352I、A546V、N593E，存在其中一个或多个突变位点的突变体都能提高糖苷转移催化能力及产量。经鉴定，本发明专利技术提供的突变体酶促合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸含量为130g/L，转化率达67.7％。转化率达67.7％。

【技术实现步骤摘要】
糖基转移酶变体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及糖基转移酶变体及其应用。

技术介绍

[0002]环糊精糖基转移酶(又称环糊精糖苷转移酶或糊精葡聚糖转移酶E.C.2.4.1.19)通过催化分子内转糖基作用可将淀粉或类淀粉多糖转化为环糊精。多数环糊精糖基转移酶同时具有对淀粉糖苷键及其他多糖的
ɑ-糖苷键降解活性以及对糖苷转移活性。这使得环糊精糖基转移酶不仅用于淀粉工业与环糊精的生产，同时也被用于某些糖苷类衍生化化合物的合成。
[0003]有许多菌属种均被发现能够产生环糊精糖苷转移酶，包括芽孢杆菌属、短杆菌属、梭菌属、棒状杆菌属等。不同环糊精糖苷转移酶对于淀粉糖苷键的降解活性、环化催化活性及糖苷转移酶活性则各有不同。其中，来自于嗜热地衣芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的环糊精糖基转移酶具备催化淀粉环化成
ɑ-环糊精和β-环糊精能力(Appl.Environ.Microbiol.1992，58(12),4016-4025)，同时该酶还具备较好的热稳定性，因而具备良好的工业应用价值。同时，嗜热地衣芽孢杆菌的环糊精糖基转移酶可催化维生素C(又称L-抗坏血酸)的C-2位置上的羟基通过转糖基作用糖基化生成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸或2-O-α-D-多糖糖基抗坏血酸。其中2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸，又称抗坏血酸葡萄糖苷、VC糖苷、维C葡糖苷、维生素C葡萄糖苷、L-抗坏血酸-2-葡萄糖苷，是一种在美妆、保健、护肤领域中是一种公认的美白、护肤、抗衰老的功效成分。
[0004]日本专利(公开号：NO.183,492/91)中公开了利用多糖糖苷转移酶(包括环糊精糖基转移酶)催化抗坏血酸与α-糖苷多糖(包括淀粉、糊精)合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的技术方案。
[0005]中国专利(公布号CN104531629A)中公开了利用嗜热地衣芽孢杆菌NO2(Geobacillus stearothermophilus NO2)的环糊精葡萄糖基转移酶酶促合成2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸，同时其公开了该酶的三种突变体，包括在228位赖氨酸突变为精氨酸(K228R)，及第367位天冬氨酸突变为突变成丝氨酸(D367S)，以及228位与367位的双突变体(K228R/D367S)。
[0006]维生素C(简称为VC)，化学名称L-抗坏血酸，是一种水溶性维生素，由于人体自身无法合成，主要通过膳食获得。VC进入人体后参与多种生理活动，在促进和维持人体健康方面起到重要的作用。此外，VC作用于皮肤可以起到美白抗氧化和促进胶原蛋白合成的功效。但是VC本身的化学结构不稳定，尤其是C-2位置上的羟基非常容易受到温度、pH及一些金属离子影响而发生氧化还原反应使其失去功效。这大大限制了VC的应用，所以如何在保持VC生理活性的同时增加其稳定性成为需要解决的问题。
[0007]VC衍生物是解决这一问题的有效手段。2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸)是一种VC的糖类衍生物，与其他VC衍生物相比，2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸是天然存在的，更安全；与VC相比，2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸对温
度、pH及金属离子等具有更强的耐受性，具有非还原活性使其在水溶液中稳定，更方便配方，在糖苷酶的作用下水解释放出VC，可以持续发挥功效，起到缓释同时避免短时过量供用。所以，2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸是VC的最佳替代品。
[0008]目前2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸合成的主要方式是酶法转化，用的主要酶为环糊精糖基转移酶。但是现有环糊精糖基转移酶对VC底物转化效率不高，添加大量的酶不利于2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸的工业化生产。

技术实现思路

[0009]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供糖基转移酶变体及其应用，该突变体具有更高的糖基转移催化活力，特别适用于工业化生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸或其他糖苷化合物。
[0010]本专利技术提供了Bacillus stearothermophilus NO2菌株CGT酶的突变体，其含有如下突变中的至少一个：R45H、K229R、F256V、V352I、A546V、N593E。
[0011]本专利技术所述的CGT酶的原始氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0012]所述突变体为在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的45位R突变为H(氨基酸序列如SEQ ID NO:6)；
[0013]所述突变体为在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的229位K突变为R(氨基酸序列如SEQ ID NO:8)；
[0014]所述突变体为在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的256位F突变为V(氨基酸序列如SEQ ID NO:10)；
[0015]所述突变体为在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的352位V突变为I(氨基酸序列如SEQ ID NO:12)；
[0016]所述突变体为在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的546位A突变为V(氨基酸序列如SEQ ID NO:14)；
[0017]所述突变体为在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的593位N突变为E(氨基酸序列如SEQ ID NO:16)；
[0018]所述突变体为在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的45位R突变为H，且229位K突变为R(氨基酸序列如SEQ ID NO:18)；
[0019]所述突变体为在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的45位R突变为H，且256位F突变为V(氨基酸序列如SEQ ID NO:20)；
[0020]所述突变体为在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的45位R突变为H、229位K突变为R，且256位F突变为V(氨基酸序列如SEQ ID NO:22)；
[0021]所述突变体为在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的45位R突变为H、229位K突变为R、256位F突变为V，且593位N突变为E(氨基酸序列如SEQ ID NO:24)；
[0022]所述突变体为在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的45位R突变为H、229位K突变为R、256位F突变为V、352位V突变为I，且593位N突变为E(氨基酸序列如SEQ ID NO:26)；
[0023]所述突变体为在如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的45位R突变为H、229位K突变为R、256位F突变为V、352位V突变为I、546位A突变为V，且593位N突变为E(氨基酸序列如SEQ ID NO:28)。
[0024]氨基酸序列如SEQ ID NO：6、8、10、18、20、22、24、26、28所示的突变体，相对酶活性更高，转化率可达50％以上。
[0025]本专利技术还提供了编码本专利技术所述突变体的DNA分子。
[0026]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Bacillus stearothermophilus NO2菌株CGT酶的突变体，其含有如下突变中的至少一个：R45H、K229R、F256V、V352I、A546V、N593E。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6、8、10、18、20、22、24、26、28所示。3.编码权利要求1或2所述突变体的DNA分子。4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5、7、9、17、19、21、23、25、27所示。5.包含编码权利要求1或2所述突变体的DNA序列的重组载体。6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，其骨架载体为pET30a(+)、pET28a(+)、pET20b(+)、pMAL-c4X、pET-SUMO中之任意一种。7.表达权利要求1或2所述突变体的宿主细胞。8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、JM109、Origami(DE3)中之任意一种。9.权利要求7或8宿主细胞的构建方法，包括：将SEQ ID NO:3所示的DNA片段连接入pET30a(+)载体，构建获得pET30a-CGT；以pET30a-CGT为模板，以含有突变位点的引物分别进行PCR扩增，所得扩增产物用DpnI酶切去除质粒模板，酶切产物直接转化感受态宿...

【专利技术属性】
技术研发人员：张跃，何汉平，
申请(专利权)人：波顿上海生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：