一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物、试剂盒及其检测方法与应用技术

本发明专利技术公开一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物、试剂盒及其检测方法与应用。本发明专利技术基于柑橘黄龙病亚洲种保守序列16S rDNA开发的RPA扩增引物HLBas

【技术实现步骤摘要】
一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物、试剂盒及其检测方法与应用


[0001]本专利技术涉及一种我国植物检疫性病害的检测技术，特别涉及一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物、试剂盒及其检测方法与应用。

技术介绍

[0002]柑橘黄龙病(Huanglongbing)是一种世界性的毁灭性病害，具有暴发性强，发展迅猛，危害大等特点，被列为我国对内对外的检疫性病害。柑橘黄龙病正在全球柑橘种植区不断扩散蔓延，如亚洲、非洲、美洲等地区。柑橘黄龙病发生流行持续时间长、发病范围广、发病率高，造成我国部分地区柑橘寿命短、产量低、生产成本高，经济损失惨重，严重制约了我国柑橘产业的健康发展。2017年我国南方柑橘生产10省(区)柑橘黄龙病发生面积16万公顷，广东省柑橘面积因黄龙病从25万公顷缩减到22万公顷，江西赣南地区的脐橙从近10万公顷剧减至5万公顷。
[0003]目前，柑橘黄龙病普遍认为是由局限于韧皮部的候选韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter spp)侵染引起，但至今未获得一致认可的纯培养。根据病原的热敏性、传播媒介、保守序列特征等可以将其分为3个种，包括：亚洲种(CandidatusLiberibacter asiaticus)、非洲种(Candidatus Liberibacter africanus)和美洲种(Candidatus Liberibacter americanus)。国内学者对柑橘黄龙病原的16S rDNA同源性分析表明，侵染我国柑橘的黄龙病菌均为亚洲种，序列测定与多重比对结果也表明在不同的地域病原菌没有发现较大的分子变异。
[0004]柑橘带病苗木、带菌接穗和田间病株是黄龙病的初侵染源。农业生产中，防控柑橘黄龙病等毁灭性病害最根本的措施之一是培育、种植无病苗木，供新区和无病区的新果园种植。自20世纪70年代柑橘茎尖嫁接脱毒研究成功后，美国、西班牙、巴西、中国等国已相继建立了各自的柑橘无病毒繁育体系。目前国内外已建立和发展了常规PCR、巢式PCR、半巢式PCR、荧光定量PCR等技术来检测柑橘黄龙病菌，不断地提高了检测的灵敏度和准确率。目前的PCR检测主要针对扩增柑橘黄龙病菌16S rDNA、23S rDNA、16S-23S rRNA ITS、OMP基因、β-operon基因、RNR基因等。
[0005]目前已建立的常规PCR、巢式PCR、荧光定量PCR等柑橘黄龙病病原检测技术，虽然不断地提高了检测的灵敏度和准确率，但是检测时间依然比较费时，荧光定量PCR由于昂贵的试验设备和试剂耗材，检测费用依然居高不下。目前测算常规PCR、巢式PCR、荧光定量PCR检测黄龙病菌单个样品的价格在100～200元之间，检测时间在3～5小时之间。常规PCR虽然检测费用较低，但检测灵敏度较低，适合田间已发病植株的检测确认。巢式PCR检测灵敏度是普通PCR的100倍，由于需要两次PCR，操作比较繁琐费时。荧光定量PCR检测灵敏度是巢式PCR的10倍，由于其高灵敏度，推动了柑橘黄龙病的早期诊断及预防控制，尤其是种苗的检测，但是荧光定量PCR的假阳性问题比较突出，操作精度要求比较高，市县级基层科研单位难以推广应用。目前开发一种高效、精准、低成本、操作简便的黄龙病病原检测技术，依然是
我国基层科研单位、广大柑橘种植企业、柑橘育苗企业的迫切需求。
[0006]重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是2006年首次报道的一种新的核酸等温扩增技术。RPA技术在25℃～42℃范围内的等温条件下，重组酶与引物DNA紧密结合形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白SSB的作用下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。目前RPA技术在医学病原物的快速诊断中得到了一些应用，在植物病原物的检测方面有一些报道，但目前尚未有RPA技术在柑橘黄龙病病原检测方面的报道。

技术实现思路

[0007]为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物。
[0008]本专利技术的另一目的在于提供一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA检测试剂盒。
[0009]本专利技术的另一目的在于提供上述快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物或RPA检测试剂盒的应用。
[0010]本专利技术的再一目的在于提供一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA检测方法。
[0011]本专利技术研发一种用于检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物及其检测方法，可为我国柑橘无病种苗的黄龙病早期检测、田间疑似黄龙病树的检测确诊、普及基层科研单位的检测能力提供有力的技术支持，从而推动我国柑橘无病种苗繁育的健康发展、提早预警广大柑橘产区柑橘黄龙病的传播扩散，进而促进我国柑橘产业的可持续发展。
[0012]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0013]本专利技术提供一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物，该RPA引物是基于柑橘黄龙病亚洲种(GenBank序列登录号：AY192576.1)16S rDNA保守序列设计的特异性引物，其核苷酸序列为：
[0014]HLBas-F：5'-CTTTAATACTGGTTGTCTAGAGTTTAGGAGAG-3'，
[0015]HLBas-R：5'-GAAAAGAAAATACCATCTCTGATATCGTCCTATA-3'。
[0016]一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA检测试剂盒，含有上述RPA引物。
[0017]所述RPA检测试剂盒还含有植物总RNA提取试剂盒、RPA扩增反应试剂、阴性对照、阳性对照。
[0018]所述阳性对照为从黄龙病阳性柑橘植株上叶片组织提取的基因组DNA，所述阴性对照为从健康柑橘植株叶片组织提取的基因组DNA。
[0019]所述的快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物在柑橘黄龙病亚洲种检测中的应用。
[0020]所述的快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA检测试剂盒在柑橘黄龙病亚洲种检测中的应用。
[0021]一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA检测方法，包括如下步骤：
[0022](1)提取待测样品基因组DNA；
[0023](2)利用待测样品基因组DNA进行RPA反应，所用的引物为上述RPA引物；
[0024](3)RPA反应完成后对反应产物进行检测；若扩增得到得到目标条带，则为阳性，即感病；若未扩增到任何条带，则为阴性，即健康。
[0025]步骤(2)中，RPA反应的反应体系包括：在反应体系中的终浓度为0.3～0.5μmol
·
L-1
的HLBas-F/HLBas-R，样品基因组DNA、RPA扩增反应试剂；
[0026]优选的，所述的HLBas-F/HLBas-R在反应体系中的终浓度为0.4μmol
·
L-1
。
[0027]步骤(2)中，RPA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物，其特征在于：所述RPA引物的核苷酸序列为：HLBas-F：5'-CTTTAATACTGGTTGTCTAGAGTTTAGGAGAG-3'，HLBas-R：5'-GAAAAGAAAATACCATCTCTGATATCGTCCTATA-3'。2.一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA检测试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的RPA引物。3.根据权利要求2所述的快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA检测试剂盒，其特征在于：所述RPA检测试剂盒还含有植物总RNA提取试剂盒、RPA扩增反应试剂、阴性对照、阳性对照。4.根据权利要求3所述的快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为从黄龙病阳性柑橘植株上叶片组织提取的基因组DNA，所述阴性对照为从健康柑橘植株叶片组织提取的基因组DNA。5.权利要求1所述的快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA引物在柑橘黄龙病亚洲种检测中的应用。6.权利要求2～4任一项所述的快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA检测试剂盒在柑橘黄龙病亚洲种检测中的应用。7.一种快速检测柑橘黄龙病亚洲种的RPA检测方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋晓兵，彭埃天，黄峰，凌金锋，崔一平，陈霞，
申请(专利权)人：广东省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：