一种甲状腺多基因联合检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种甲状腺多基因联合检测试剂盒。本发明专利技术试剂盒包含：DNA文库构建的专用接头；检测融合基因和点突变的特异性复合引物；文库扩增复合引物。本发明专利技术试剂盒通过对送检样品的DNA和RNA共同提取，对RNA进行逆转录成cDNA后，与DNA一起进行高通量测序文库构建，并进行高通量测序，能一次性检测包括CCDC6

【技术实现步骤摘要】
一种甲状腺多基因联合检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种甲状腺多基因联合检测试剂盒。

技术介绍

[0002]甲状腺结节是人群中普遍存在的一种甲状腺疾病，是甲状腺细胞在局部异常生长所引发的病变。大多数情况下，甲状腺结节是良性的，可以采取保守治疗的方式，但也有5%-10%的甲状腺结节是恶性的，即甲状腺癌，需要早期手术治疗，才能获得良好的预后效果。目前，通过细针穿刺（FNA）的方法获取甲状腺细胞，进行细胞学检查是当今评估甲状腺结节是否为恶性肿瘤的金标准。然而，仍有20%-30%的甲状腺结节无法通过这种方式获得明确诊断。
[0003]随着分子生物学技术的进展，分子诊断在甲状腺结节良恶性的鉴别诊断中，逐渐受到人们的关注。美国国立综合癌症网络（NCCN）2019年版的临床实践指南中明确指出：（1）对细针穿刺无法确定的疑似滤泡型及Hurthle细胞癌（诊断依据为血管或包膜的浸润），分子检测有助于判定其良恶性；（2）细胞学无法明确诊断的结节，利用分子诊断的技术，检测BRAF、RAS、RET/PTC、PAX8/PPARγ等癌基因的变异对辅助诊断甲状腺癌具有重要作用。
[0004]目前的研究表明基因融合是甲状腺癌发病的决定性因素之一，癌症基因组计划（The Cancer Genome Atlas）绘制的甲状腺癌的遗传图谱提示，基因融合占据了甲状腺癌基因突变的20%左右。因此鉴定出甲状腺癌组织中的基因融合及相关基因突变情况对于甲状腺癌的精准诊断和治疗有重要意义。
[0005]目前基因融合的检测，主要依赖于实时荧光定量PCR（Real Time PCR，RT-PCR）、荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）和免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）等。FISH和IHC均采用探针杂交原理对已知的基因融合进行检测，一般一次仅检测一种类型的基因融合，操作流程复杂，成本较高；RT-PCR具有相对较高的检测通量，但需要的样品量较多，实验操作步骤多，检测费用较高。对于标志性突变位点通常采用特异性引物进行PCR检测。但没有发现对于甲状腺结节能够实现一个试剂盒的一管反应同时检出基因融合突变和点突变。
[0006]中国专利CN111349694A公开了一种甲状腺癌相关基因融合突变的检测方法及试剂盒，虽然能检测RET/PTC1融合、RET/PTC3融合及PAX8-PPARG重排这三种甲状腺癌相关基因融合突变情况，但不能检测BRAF、KRAS、NRAS、HRAS、TERTp等点突变。
[0007]又如中国专利CN110241215B公开了一种用于检测甲状腺结节良恶性相关基因变异的引物及试剂盒，可以同时检测6个基因的15个位点的变异以及3个融合基因变异，其中包括BRAF基因、KRAS基因、HRAS基因、NRAS基因、TERT基因、EIF1AX基因和RET/PTC1融合、RET/PTC3融合、PAX8/PPARγ融合，但该技术方案存在以下缺点：对于融合基因伴侣基因检测范围较小，只能检测PTC1/RET和PTC3/RET两种融合类型；构建的DNA测序文库复杂度低，易产生假阳性；操作复杂，需要独立进行RNA和DNA两份文库构建。
[0008]再如CN110878358A公开了一组甲状腺癌标志物及其应用，该专利针对甲状腺分子
分型、靶向用药、化疗用药、手术提示、预后及遗传相关的44种基因的全外显子区域，进行高深度测序同时分析基因的SNV/Indel、基因融合等多种变异类型，深度解析甲状腺结节以及甲状腺癌的分子层面信息，针对44种基因设计的捕获探针，覆盖了558个靶向目标区域，探针包括3633条序列，大小共计254.096Kbp，制备的试剂盒覆盖面广，性价比高，实效性强，可以对甲状腺患者进一步的分子分型、用药提示、遗传风险评估等提供参考依据，适于临床推广应用。缺点是：液相杂交成本较高，且操作流程复杂。
[0009]而传统的荧光PCR法检测则存在每次只能检测一个位点，需要的样品量较多；检测成本较高；实验操作数量较多，检测程序耗时长等缺陷。
[0010]综上，上述方法均只能对已知的基因融合检测或对点突变进行检测，并且受限于检测通量的限制，无法对甲状腺肿瘤致癌的融合基因和点突变实现一次性的全检测。而据众多研究报道，甲状腺癌的致病性基因融合已经超过40种，并且有大量的新的基因融合及基因突变被陆续报道。因此，开发一种能快速同时检测融合基因和点突变的试剂盒，对于甲状腺癌的临床研究和诊断具有重要的意义。

技术实现思路

[0011]针对现有技术存在的不足，本专利技术要解决的技术问题是为了能同时检测甲状腺肿瘤相关多基因的、已知及未知基因融合和突变情况，提供了一种甲状腺多基因联合检测试剂盒，通过对送检样品的DNA和RNA共同提取，对RNA进行逆转录成cDNA后，与DNA一起进行高通量测序文库构建，并进行高通量测序，能一次性检测包括CCDC6-RET/NCOA4-RET融合及PAX8/PPARγ融合，BRAF(V600E)、HRAS(61)、NRAS(61)、KRAS(12,13)、KRAS(61)、TERTp等多种点突变，可以为甲状腺癌患病个体提供精准诊断和治疗，并可为甲状腺结节患者进行癌症风险评估。
[0012]为解决上述技术问题，本专利技术提供以下技术方案。
[0013]一方面，本专利技术提供了一组用于检测融合基因和点突变的特异性复合引物，所述的特异性复合引物的序列如下表1所示。
[0014]表1 特异性复合引物序列
名称引物序列检测位点通用引物1（SEQIDNO:10）AATGATACGGCGACCACCGAGAT和特异性引物1-8分别配对特异性引物1（SEQIDNO:11）GTGACTGGAGTTCAGACGTGCGCTCTTCCGATCCTTCCGAGGGAATTCCCACTTTGGATCCCCDC6-RET/NCOA4-RET特异性引物2（SEQIDNO:12）GTGACTGGAGTTCAGACGTGCGCTCTTCCGATCGGGCCAGAATGGCATCTCTGTGTCAACCPAX8/PPARγ特异性引物3（SEQIDNO:13）GTGACTGGAGTTCAGACGTGCGCTCTTCCGATCCTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGBRAF(V600E)特异性引物4（SEQIDNO:14）GTGACTGGAGTTCAGACGTGCGCTCTTCCGATCACCGGAAGCAGGTGGTCATTGATGGHRAS(61)特异性引物5（SEQIDNO:15）GTGACTGGAGTTCAGACGTGCGCTCTTCCGATCCCTCATGTATTGGTCTCTCATGGCACTGTNRAS(61)特异性引物6（SEQIDNO:16）GTGACTGGAGTTCAGACGTGCGCTCTTCCGATCAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGCCKRAS(12,13)特异性引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组用于检测融合基因和点突变的特异性复合引物，其特征在于，所述的检测融合基因和点突变的特异性复合引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10-SEQ ID NO:18所示。2.一种甲状腺多基因联合检测试剂盒，其特征在于，所述的甲状腺多基因联合检测试剂盒包含权利要求1所述的检测融合基因和点突变的特异性复合引物。3.根据权利要求2所述的甲状腺多基因联合检测试剂盒，其特征在于，所述的甲状腺多基因联合检测试剂盒还包括一种DNA文库构建的专用接头，所述的DNA文库构建的专用接头为接头引物1分别和8条不同的i5端引物构成的8个二聚体；所述的接头引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述的8条不同的i5端引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:9所示。4.根据权利要求2所述的甲状腺多基因联合检测试剂盒，其特征在于，所述的甲状腺多基因联合检测试剂盒还包括一组文库扩增复合引物，所述的文库扩增复合引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:19-SEQ ID NO:27所示。5...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙石磊，姬云，
申请(专利权)人：苏州科贝生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：