含抗性标记的恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotN基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法技术

本发明专利技术提供了一种含抗性标记的恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotN基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法，为进一步研究接合转移系统提供基础。含抗性标记的恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotN基因缺失突变菌，其生物保藏编号为CGMCC No.20501。No.20501。No.20501。

【技术实现步骤摘要】
含抗性标记的恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotN基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种含抗性标记的恶臭假单胞菌 ND6偶联蛋白复合体dotN基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法。

技术介绍

[0002]萘作为多环芳烃类污染物之一广泛存在于土壤环境中，由于具有水溶性，因此极易发生扩散现象，因其具有“三致”效应(致癌、致畸、致突变)，会对人体血液健康造成一定的威胁。
[0003]目前已知的萘降解菌属种类非常多，在萘的生物降解过程中，萘降解基因大部分存在于独立染色体之外的质粒上，称为萘降解质粒，这类质粒通常能够进行接合转移完成水平基因转移。恶臭假单胞菌ND6是萘降解菌属的一种，其包含有两个巨型质粒：pND6-1和pND6-2，实现萘降解和接合转移的功能基因分别位于这两个质粒之上，其具有接合转移系统，会发生接合转移。在恶臭假单胞菌ND6的实际应用过程中，发现接合转移系统没有选择性，不仅能将ND6的萘降解能力转移给其他菌株，同时还能将ND6的其他能力转移给其他菌株，易引发基因二次污染，造成生态环境失衡，并不利于萘降解。
[0004]因此，有必要在恶臭假单胞菌ND6的基础上构建一种具有萘降解能力但又不会造成又不会造成因基因二次污染导致生态环境失衡的菌株。

技术实现思路

[0005]鉴于此，特提出本专利技术，提供含抗性标记的恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotN基因缺失突变菌及其构建方法、测定方法，本专利技术目的有两个，其一是提供一种具有萘降解能力但又不会造成因基因二次污染导致生态环境失衡的菌，其二是为进一步研究接合转移系统提供基础。
[0006]本专利技术的构思是：
[0007]目前，关于接合转移系统的研究主要是集中在IVB型分泌系统 (T4BSS)上。典型的T4BSS由30多个基因编码的蛋白组成，这些基因大多倾向于聚在一起形成基因簇。其中，偶联蛋白复合体正是组成接合转移系统的一部分，它是由dotM-dotL-dotN基因簇所编码的蛋白组成，在整个接合转移系统中充当底物识别蛋白，同时水解ATP为接合转移提供能量。由于接合转移系统不具有选择性，会造成基因二次污染，因此，从接合转移系统着手，通过抑制菌的接合转移能力，使菌株在应用时，仅表达萘降解的能力，避免基因二次污染。
[0008]为实现上述目的，本专利技术所提供的技术解决方案是：
[0009]含抗性标记的恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotN基因缺失突变菌，其生物保藏编号为CGMCC No.20501，其dotN基因缺失第83900～84613 位核苷酸。
[0010]同时，本专利技术还提供了上述含抗性标记的恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotN基因缺失突变菌的构建方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：
[0011]1)基因的克隆与重组自杀质粒的构建
[0012]1.1)参照DNA数据库(比如：GenBank)中dotN基因序列，以ND6 基因组为模板体外扩增，得到dotM基因上下游片段；
[0013]1.2)通过重叠延伸PCR技术将步骤1.1)得到的所述dotN基因上下游片段与抗性标记基因片段进行连接，得到重组片段；
[0014]1.3)将步骤1.2)得到的所述重组片段连接至携带蔗糖敏感基因 (sacB)的自杀质粒上，构建缺失了第83900～84613位核苷酸的dotN基因的重组自杀质粒，即含抗性标记基因的重组自杀质粒；
[0015]2)基因的克隆与重组自杀质粒的转化
[0016]2.1)首次鉴定筛选
[0017]2.1.1)通过热转化或电转化方法，将步骤1)得到的所述重组自杀质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中，得到包含重组自杀质粒的大肠杆菌；
[0018]2.1.2)将步骤2.1.1)得到的大肠杆菌中的所有重组自杀质粒提取出，通过聚合酶链式反应(PCR)、酶切以及测序三种方法对所有重组自杀质粒进行鉴定，筛选出正确的重组自杀质粒；其中，聚合酶链式反应(PCR)用于验证上游片段、抗性标记基因片段以及下游片段是否进行合理连接，酶切用于验证重组自杀质粒的大小是否正确，测序用于验证重组自杀质粒中插入的片段是否来源于ND6基因序列及抗性标记基因片段的基因序列；
[0019]2.2)转化
[0020]将步骤2.1)得到的正确的重组自杀质粒转化至具有接合转移能力的大肠杆菌感受态细胞中，得到包含正确重组自杀质粒并具有接合转移能力的大肠杆菌；
[0021]2.3)再次鉴定筛选
[0022]通过聚合酶链式反应(PCR)和酶切两种方法对步骤2.2)得到的大肠杆菌进行鉴定，筛选出包含正确重组自杀质粒并具有接合转移能力的大肠杆菌；
[0023]3)接合转移与恶臭假单胞菌ND6单编码基因缺失突变菌的构建
[0024]3.1)以步骤2)得到的包含正确重组自杀质粒并具有接合转移能力的大肠杆菌作为供体菌，野生型恶臭假单胞菌ND6作为受体菌进行滤膜杂交完成接合转移后，涂布在含有抗生素Ⅰ、氨苄青霉素(Amp)以及质量分数为 10～30％蔗糖的培养皿上进行培养，得到接合子；所述抗生素Ⅰ与所述抗性标记基因表达相同的抗性；
[0025]3.2)通过聚合酶链式反应(PCR)对步骤3.1)得到的接合子进行鉴定，筛选出同时含有所述抗性标记基因和不含所述蔗糖敏感基因的接合子，确保正确的重组自杀质粒已经整合到ND6染色体上，且不包含携带蔗糖敏感基因的重组自杀质粒，从而构建出含抗性标记的恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotN基因缺失突变菌。
[0026]进一步地，步骤1.1)的具体步骤为：
[0027]A)ND6基因组DNA提取
[0028]A1)取活性恶臭假单胞菌ND6接种于培养基进行活化，于25℃～30℃培养箱中培养，形成菌落；
[0029]A2)挑单菌接种于含有浓度为20～30μg/mL氨苄霉素(Amp)的液体培养基中，于25～30℃下培养得到菌液；
[0030]A3)取1.5～3ml步骤A2)得到的菌液转移至离心管中，经8000 ～12000rpm，1～
3min离心后弃上清液，收集菌体；
[0031]A4)利用细菌基因组DNA提取试剂盒从步骤A3)得到的菌体中提取出 ND6基因组，并进行扩增，得到含有dotN基因上下游片段的溶液；
[0032]B)核酸物质的胶回收纯化
[0033]B1)将所述溶液注入琼脂糖凝胶的梳空内，电泳20min～35min；
[0034]B2)在紫外灯下，切下所需dotN基因上下游片段，置于离心管中，并向离心管中加入与所述琼脂糖凝胶等倍体积的结合缓冲液(Binding Buffer)，置于55～65℃水浴中至琼脂糖凝胶完全融化，得到DNA-琼脂糖溶液；
[0035]B3)将所述DNA-琼脂糖溶液转移至核酸吸附柱中，并对核酸吸附柱进行洗脱，得到纯化的dotN基因上下游片段。
[0036]进一步地，1.3)的具体步骤为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种含抗性标记的恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotN基因缺失突变菌，其生物保藏编号为CGMCC No.20501。2.权利要求1所述含抗性标记的恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotN基因缺失突变菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)基因的克隆与重组自杀质粒的构建1.1)参照DNA数据库中dotN基因序列，以ND6基因组为模板体外扩增，得到dotM基因上下游片段；1.2)通过重叠延伸PCR技术将步骤1.1)得到的所述dotN基因上下游片段与抗性标记基因片段进行连接，得到重组片段；1.3)将步骤1.2)得到的所述重组片段连接至携带蔗糖敏感基因的自杀质粒上，构建缺失了第83900～84613位核苷酸的dotN基因的重组自杀质粒；2)基因的克隆与重组自杀质粒的转化2.1)首次鉴定筛选2.1.1)将步骤1)得到的所述重组自杀质粒转化至大肠杆菌感受态细胞中，得到包含重组自杀质粒的大肠杆菌；2.1.2)将步骤2.1.1)得到的大肠杆菌中的所有重组自杀质粒提取出，通过聚合酶链式反应、酶切以及测序三种方法对所有重组自杀质粒进行鉴定，筛选出正确的重组自杀质粒；2.2)转化将步骤2.1)得到的正确的重组自杀质粒转化至具有接合转移能力的大肠杆菌感受态细胞中，得到包含正确重组自杀质粒并具有接合转移能力的大肠杆菌；2.3)再次鉴定筛选通过聚合酶链式反应和酶切两种方法对步骤2.2)得到的大肠杆菌进行鉴定，筛选出包含正确重组自杀质粒并具有接合转移能力的大肠杆菌；3)接合转移与恶臭假单胞菌ND6单编码基因缺失突变菌的构建3.1)以步骤2)得到的包含正确重组自杀质粒并具有接合转移能力的大肠杆菌作为供体菌，野生型恶臭假单胞菌ND6作为受体菌进行滤膜杂交完成接合转移后，涂布在含有抗生素Ⅰ、氨苄青霉素以及质量分数为10～30％蔗糖的培养皿上进行培养，得到接合子；所述抗生素Ⅰ与所述抗性标记基因表达相同的抗性；3.2)通过聚合酶链式反应对步骤3.1)得到的接合子进行鉴定，筛选出同时含有所述抗性标记基因和不含所述蔗糖敏感基因的接合子，确保正确的重组自杀质粒已经整合到ND6染色体上，且不包含携带蔗糖敏感基因的重组自杀质粒，从而构建出含抗性标记的恶臭假单胞菌ND6偶联蛋白复合体dotN基因缺失突变菌。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤1.1)的具体步骤为：A)ND6基因组DNA提取A1)取活性恶臭假单胞菌ND6接种于培养基进行活化，于25℃～30℃培养箱中培养；A2)挑单菌接种于含有浓度为20～30μg/mL氨苄霉素的液体培养基中，于25～30℃下培养得到菌液；A3)取1.5～3ml步骤A2)得到的菌液转移至离心管中，经8000～12000rpm，1～3min离心后弃上清液，收集菌体；
A4)利用细菌基因组DNA提取试剂盒从步骤A3)得到的菌体中提取出ND6基因组，并进行扩增，得到含有dotN基因上下游片段的溶液；B)核酸物质的胶回收纯化B1)将所述溶液注入琼脂糖凝胶的梳空内，电泳20min～35min；B2)在紫外灯下，切下所需dotN基因上下游片段，置于离心管中，并向离心管中加入与所述琼脂糖凝胶等倍体积的结合缓冲液，置于55～65℃水浴中至琼脂糖凝胶完全融化，得到DNA-琼脂糖溶液；B3)将所述DNA-琼脂糖溶液转移至核酸吸附柱中，并对核酸吸附柱进行洗脱，得到纯化的dotN基因上下游片段。4.根据权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于，1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李珊珊，杜丹，徐浩，延卫，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：