TCR多样性的测定方法和应用技术

本发明专利技术涉及测定受试者的TCR多样性的方法，包括使用外周血RNA通过反转录PCR和巢氏PCR建立TCR多样性测序文库，以及使用所述文库测定TCR多样性。测定TCR多样性。测定TCR多样性。

【技术实现步骤摘要】
TCR多样性的测定方法和应用


[0001]本专利技术涉及免疫诊断领域，具体来说涉及通过测定TCR多样性来确定受试者的免疫状态，进而对治疗效果和预后进行预测性诊断的方法和系统。

技术介绍

[0002]肺癌是全球癌症死亡的主要原因，是我国发病率和死亡率均居首位的恶性肿瘤。70％～80％的肺癌患者就诊时已处于中晚期，错过了最佳的治疗时机，具有五年生存率低、预后差的特点。临床医生对晚期肺癌患者临床获益和预期生存时间的可靠评估非常重要，有助于医生和患者共同选择合适的治疗方案，从而实现个体化治疗。
[0003]晚期肺癌患者的全身免疫状态与其临床结局密切相关，而适应性免疫状态是抗肿瘤治疗的关键影响因素。机体抗肿瘤免疫应答以细胞免疫应答为主，其中T细胞介导的免疫应答在杀伤肿瘤细胞、控制肿瘤生长中至关重要。T 细胞通过T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)识别肿瘤抗原，引起效应细胞的激活和效应分子的释放，从而激活抗肿瘤免疫。在这一过程中，TCR多样性是特异性识别肿瘤抗原、产生有效免疫应答的先决条件。机体免疫系统的主要T细胞群体是αβT细胞，其多样性由α链和β链的可变区(V区)决定。每条肽链的可变区包含三个高可变环区：CDR1、CDR2和CDR3，CDR1和 CDR2由V基因编码，序列相对保守，与MHC分子结合；而CDR3区由重组的V(D)J编码，具有超变性，与抗原肽直接结合，是TCR识别抗原的核心部分。因此，T细胞CDR3的多样性能够直接反应出T细胞的功能及机体适应性免疫状态。
[0004]既往已有关于晚期肺癌患者外周血免疫组库的相关研究，该研究采用了以基因组DNA为模板的免疫组库测序技术，对外周血中T淋巴细胞受体 CDR3序列进行测序，发现晚期肺癌患者的外周血TCR组库与健康人存在显著差异，还发现治疗前后外周血TCR多样性增加超过10％和重叠指数高的晚期肺癌患者预后较好(Liu Y等.Characteristics and prognostic significance of profiling the peripheral blood T-cell receptor repertoire in patients withadvanced lung cancer[J].International Journal of Cancer，2019)。然而，基于Liu 等人的文章中的分析结果，未经治疗组的基线多样性水平与包括持续临床获益(DCB；durable clinical benefit)和无进展生存期(PFS；progress-free survival)的预后指标上并没有展现出显著关联。
[0005]然而，使用基因组DNA为模板的免疫组库测序技术存在一些缺陷。一方面重组的V(D)J基因只占基因组DNA非常少的一部分，代表性相对较差；另一方面使用基因组DNA作为模板会产生背景杂质，包括不参与重组的 V(D)J基因和内含子，加上多重PCR带来的非特异性扩增，误差相对较大。
[0006]另外，对于获得的TCR测序数据如何进行分析，使其更有价值也是本领域不断探索的课题。
[0007]因此，需要一种更准确、高效的方法来利用TCR组库测序结果预测患者的预后。
3
’
(SEQ ID NO：4)；
[0032]第二轮PCR引物：
[0033]上游引物：5
’-
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCC CTACACGACG-3
’
(SEQ ID NO：5)；
[0034]下游引物：5
’-
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTG ACTGGAGTTCAGACGTGTG-3
’
(SEQ ID NO：6)。
[0035]优选地，步骤(2.2)进行三轮巢氏PCR，并且分别使用如下引物：
[0036]第一轮PCR引物：
[0037]上游引物：5
’-
AAGCAGTGGTATCAACGCAG-3
’
(SEQ ID NO：7)；
[0038]下游引物：5
’-
GTGTGGCCTTTTGGGTGTGG-3
’
(SEQ ID NO：8)；
[0039]第二轮PCR引物：
[0040]上游引物：5
’-
TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAGCAGT GGTATCAACGCAG(SEQ ID NO：3)；
[0041]下游引物：5
’-
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT TCTGATGGCTCAAACACAGC-3
’
(SEQ ID NO：4)；
[0042]第三轮PCR引物：
[0043]上游引物：5
’-
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCC CTACACGACG-3
’
(SEQ ID NO：5)；
[0044]下游引物：5
’-
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-barcode-GTG ACTGGAGTTCAGACGTGTG-3
’
(SEQ ID NO：6)。
[0045]在具体的实施方案中，步骤(4)中的TCR多样性是通过计算香农-威纳指数并以10为底对该指数进行对数换算确定的。
[0046]所述受试者是肿瘤患者，优选癌症患者，更优选晚期癌症患者，最优选晚期肺癌患者；所述癌症选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌和肺大细胞癌。
[0047]第一方面的方法可用于在治疗前、治疗中或治疗后测定受试者的TCR 多样性。
[0048]专利技术人发现，受试者治疗前的基线外周血TCR多样性可以作为肺癌患者无进展生存期的独立预后指标。
[0049]因此，第二方面，本专利技术涉及根据受试者的基线TCR多样性测定受试者免疫状态、预测受试者预后的方法，其中所述基线TCR多样性是根据第一方面的方法在受试者进行治疗前测定的。所述治疗包括化疗、细胞治疗、免疫治疗、细胞治疗。优选地，所述治疗是免疫检查点抑制性或激活性治疗。预测受试者预后包括预测受试者无进展生存期的长短。所述基线TCR多样性可以与预先设定的阈值或来自其他受试者的已知数据进行比较，由此判定受试者的免疫状态或治疗预后。所述受试者为晚期肺癌患者时，所述预先设定的阈值为约3.91，当受试者的TCR多样性高于该阈值时，判断所述受试者具有较好的预后；当受试者的TCR多样性低于该阈值时，判断所述受试者具有较差的预后。
[0050]专利技术人还发现，治疗后的外周血TCR多样性可以用于建立评估受试者适应性免疫状态的模型，从而预测预后。
[0051]因此，第三方面，本专利技术涉及根据受试者治疗后的TCR多样本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种测定受试者TCR多样性的方法，包括：(1)从受试者的外周血提取总RNA；(2)使用步骤(1)提取的总RNA构建受试者的TCR序列文库；(3)使用步骤(2)获得的TCR序列文库进行DNA测序；(4)基于步骤(3)的测序结果计算TCR多样性，所述TCR多样性通过计算香农-威纳指数并以10为底对该指数进行对数换算确定。2.权利要求1的方法，其中所述步骤(2)中的文库构建使用反转录PCR和多轮巢氏PCR，其中所述反转录PCR通过模板技术对TCRβ链(TRB)的CDR3的V、D和J区进行反转录，并在cDNA的3
’
端添加共有序列和分子标签，并且在至少两轮巢氏PCR中添加部分测序接头，使得最终的PCR产物具有完整的测序接头。3.权利要求1的方法，其中所述受试者是肿瘤患者，优选癌症患者，更优选晚期癌症患者，最优选晚期肺癌患者；所述癌症选自非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺鳞状细胞癌、肺腺癌和肺大细胞癌，优选非小细胞肺癌或小细胞肺癌。4.一种通过TCR多样性预测受试者对于治疗的预后的方法，包括：(1)使用权利要求1-4中任一项的方法获得所述受试者的TCR多样性；(2)通过将所述TCR多样性与预先设定的阈值或对于所述治疗的治疗结果已知的患者群体的TCR多样性进行比较，判断所述受试者的预后状态；其中所述TCR多样性是治疗前或治疗后的TCR多样性，优选治疗前TCR多样性。5.权利要求4的方法，其中所述受试者为晚期肺癌患者，并且所述预先设定...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯林，王嘉琪，程书钧，肖汀，张开泰，张雅静，
申请(专利权)人：中国医学科学院肿瘤医院，
类型：发明
国别省市：