一种降低单细胞扩增偏倚性的离体组织细胞核分离方法技术

本发明专利技术公开了一种降低扩增偏倚性的单细胞测序的细胞核分离方法及其应用，该方法包括：将待提取样品在在二号缓冲液中进行裂解处理；将裂解产物进行第一次离心处理，获得细胞核沉淀；将所述细胞核沉淀进行冲洗并在一号缓冲液中重悬，并进行第二次离心处理，最终在三号缓冲液中重悬混匀，以获得最终所需的细胞核。该方法只需常规、简单的试剂耗材，不需要昂贵的分离设备及长时间的梯度离心等操作，便可从较少的组织样本或者细胞中获得足量、完整的单个细胞核用于单细胞全基因实验研究，该方法相较于市售试剂盒处理过的细胞核，用于后续的全基因组扩增产物具更好的扩增均一性，与完整的单个细胞具备相近的扩增效果，同时省时且节约成本。约成本。约成本。

【技术实现步骤摘要】
一种降低单细胞扩增偏倚性的离体组织细胞核分离方法


[0001]本专利技术涉及基因测序领域，本专利技术涉及适用于一种降低单细胞扩增偏倚性的离体组织细胞核分离方法。

技术介绍

[0002]单细胞测序是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组等多组学进行高通量测序分析的新技术。改技术的应用使得解释单个细胞的基因结构和基因表达状态，解读细胞间的异质性成为了可能。单细胞测序以备广泛可应用于发育生物学、免疫、肿瘤等方向的研究，并且涌现出大量高质量的研究和科研成果。其中单细胞全基因组测序通过对肿瘤组织中解离后得到的单个细胞的DNA进行全基因组扩增，再进行文库构建及测序，分析每个细胞中的基因情况，研究肿瘤发生发展机制、分子分型等，为肿瘤分型、肿瘤治疗策略、新药研发等提供新的方向。
[0003]单细胞测序对样本活性要求较高。人肿瘤组织多坏死病灶，不易获得高活率单细胞悬液，而且单细胞悬液运输过程中无法保证细胞活率。目前的实现方法是携带单细胞分离设备至医院，手术切下的新鲜离体组织立即进行消化及后续的分离处理，使该实验在成本、时间、地点等方面受到较大限制。因此有必要开发一种新的样本处理方法，更便捷地获得合适的样本进行单细胞全基因组测序。
[0004]将新鲜的离体肿瘤组织用液氮冷冻为冰冻组织后可用干冰运输及保存，但解冻后难以消化获得高活率的单细胞悬液。在新鲜组织快速冷冻及冷冻保存的过程中会对细胞造成较大的损伤，细胞内RNA游离损失，导致无法进行单细胞RNA测序，而核膜在冻融的过程中可以保持完整。有研究证明细胞核中包含足够量的基因组DNA，可用于测序，且与用完整细胞进行基因组测序具有较高的相关性。由于核膜比细胞膜更易保持完整，与获得单细胞悬液相比，从冰冻组织中获得细胞核悬液的可操作性更强。目前从冰冻组织中获得单核悬液还没有成熟稳定的方法，目前仅有通过昂贵的辅助设备针对冰冻脑组织的单核悬液分离方法，且没有质控结果的展示说明。
[0005]同时医院样本库有大量的特色病例、珍稀冷冻标本，这些冰冻样本的利用可以为研究稀有病种、缩短研究周期有很大的帮助。
[0006]因而，开发一种简单、方便的分离人离体冰冻肿瘤组织细胞核，获得高活率的单细胞核悬液的方法迫在眉睫。

技术实现思路

[0007]本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题：如何利用简单、方便的方法分离离体冰冻肿瘤组织细胞核。为此，专利技术人开发了一种简便的方法，可以从离体冰冻肿瘤组织样本中获得适用于单细胞测序的单核悬液，解除新鲜离体肿瘤组织单细胞测序对时间地点的限制，使单细胞测序技术可以更广泛地应用于离体肿瘤组织微环境的研究。
[0008]本专利技术第一方面是一种提取细胞核的方法，该方法的步骤包括：
[0009]1)在二号缓冲液(LB)中进行样品机械裂解处理，经过冰置处理和吹打处理后获得裂解产物；
[0010]2)将裂解产物进行第一过滤处理及第一离心处理，获得第一离心细胞核沉淀；
[0011]3)将第一离心细胞核沉淀在第一缓冲液(WB)中进行冲洗及第一重悬处理和第二过滤处理，然后进行第二次离心处理，获得第二离心细胞核沉淀；
[0012]4)将第二离心细胞核沉淀在三号(NB)缓冲液中进行第二重悬混匀处理后进行第三过滤处理，获得的细胞核悬液；
[0013]进一步地，样品为离体样本。
[0014]优选地，离体样本为离体冰冻肿瘤组织或体外培养的贴壁细胞。
[0015]进一步地，一号缓冲液(WB)包括：10-20mM Tris-HCl(pH 7.5-7.8)，10-20mM NaCl，50-100mM KCl，2-10mM MgCl2，5-15mM CaCl2，0.04％BSA，1mg/mL PI以及0.2U/μL RNase抑制剂；
[0016]进一步地，样品与一号缓冲液(WB)的质量体积比为5mg:0.5mL。
[0017]进一步地，二号缓冲液(LB)包括：一号缓冲液(WB)含0.2％NP-40(质量体积比)。
[0018]进一步地，三号缓冲液(NB)包括：含1％FBS，1mM DTT的D-Hanks缓冲液。
[0019]进一步地，使用前，一号缓冲液(WB)，二号缓冲液(LB)以及三号缓冲液(NB)预先经过4℃预冷处理。
[0020]进一步地，步骤1)中使用研磨杵进行机械研磨破碎处理。
[0021]进一步地，步骤1)中破碎处理后的样品体积≤0.2mm3。
[0022]进一步地，步骤1)中冰置处理时间为8-10min，利用移液枪混匀。
[0023]进一步地，步骤1)中吹打处理为10-15次。
[0024]进一步地，步骤2)中第一过滤处理是通过直径为70μm的细胞过滤器进行。
[0025]进一步地，步骤2)中第一离心处理是在4℃、500g的条件下进行5min。
[0026]进一步地，步骤3)中第一重悬处理中一号缓冲液(WB)的用量为0.5mL。
[0027]进一步地，步骤3)中第二过滤处理是通过直径为40μm的细胞过滤器进行。
[0028]进一步地，步骤3)中将第二过滤处理获得的滤液收集在新的离心管中，进行第二离心处理，第二离心处理是在4℃、300g的条件下进行5min。
[0029]进一步地，步骤4)中第三过滤处理是通过直径为40m的细胞过滤器进行。
[0030]进一步地，步骤4)中第二离心细胞核沉淀在0.2mL的三号缓冲液(NB)进行第二重悬混匀处理。
[0031]进一步地，对细胞核悬液中的细胞核进行单细胞全基因扩增及扩增均一性检测。
[0032]进一步地，单细胞全基因组测序前，进一步将细胞核进行重悬处理，所述重悬处理后，细胞核的浓度为1000核/μL。
[0033]本专利技术第二方面提供了一种基于本专利技术第一方面细胞核提取方法的一种提取离体冰冻肿瘤组织的细胞核的方法，该方法包括：
[0034]步骤A1，第二缓冲液预先经过4℃预冷处理，将离体冰冻肿瘤组织在第二缓冲液(LB)中进行机械破碎处理，离体冰冻肿瘤组织与第二缓冲液的质量体积比为不超过5mg:0.5mL，破碎处理后的离体冰冻肿瘤组织体积≤0.2mm3，将机械破碎处理产物冰置处理5～10min，利用移液枪混匀；然后将冰置处理产物进行10～15次吹打处理，获得吹打处理产物；
[0035]步骤A2，将步骤A1获得的吹打处理产物进行第一过滤处理，第一过滤处理是通过直径为70μm的细胞过滤器进行的，经第一过滤处理后的滤液构成裂解产物，将裂解产物在4℃、500g的条件下进行5min的第一离心处理，获得细胞核沉淀；
[0036]步骤A3，将细胞核沉淀在一号缓冲液(WB)中进行重悬处理，一号缓冲液(WB)的用量为0.5mL，一号缓冲液(WB)重悬后的构成第一重悬后的细胞核悬液；
[0037]步骤A4，将第一重悬后的细胞核悬液进行第二过滤处理，第二过滤处理是通过直径为40μm的细胞过滤器进行的，第二过滤处理后的滤液构成第二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提取细胞核的方法，其特征在于，所述方法的步骤包括：1)在二号缓冲液(LB)中进行样品机械裂解处理，经过冰置处理和吹打处理后获得裂解产物；2)将所述裂解产物进行第一过滤处理及第一离心处理，获得第一离心细胞核沉淀；3)将所述第一离心细胞核沉淀并在第一缓冲液(WB)中进行及冲洗第一重悬处理和第二过滤处理，然后进行第二次离心处理，获得第二离心细胞核沉淀；4)将所述第二离心细胞核沉淀在三号(NB)缓冲液中进行第二重悬混匀处理后进行第三过滤处理，获得的细胞核悬液，所述细胞核悬液在单细胞全基因组测序和扩增均一性检测前，进一步将细胞核进行重悬处理，经过重悬处理后，所述细胞核的浓度为1000核/μL；其中，所述样品为离体样本；所述一号缓冲液(WB)包括：10-20mM Tris-HCl(pH 7.5-7.8)，10-20mM NaCl，50-100mM KCl，2-10mM MgCl2，5-15mM CaCl2，0.04％BSA，1mg/mL PI以及0.2U/μL RNase抑制剂；所述样品与所述一号缓冲液(WB)的质量体积比为5mg:0.5mL；所述二号缓冲液(LB)为一号缓冲液(WB)含0.2％NP-40(质量体积比)；所述三号缓冲液(NB)为含1％FBS，1mM DTT的D-Hanks缓冲液；使用前，所述一号缓冲液(WB)，所述二号缓冲液(LB)以及所述三号缓冲液(NB)预先经过4℃预冷处理；步骤1)中破碎处理后的所述样品体积≤0.2mm3；步骤1)中所述冰置处理时间为8-10min并利用移液枪混匀，步骤1)中所述吹打处理为10-15次；步骤2)中所述第一离心处理是在4℃、500g的条件下进行5min；步骤3)中第二过滤处理是通过直径为40μm的细胞过滤器进行；步骤4)中第二过滤处理是通过直径为40μm的细胞过滤器进行。2.如权利要求1所述的一种提取细胞核的方法，其特征在于，步骤1)中使用研磨杵进行所述机械裂解处理。3.如权利要求1所述的一种提取细胞核的方法，其特征在于，步骤2)中所述第一过滤处理是通过直径为70μm的细胞过滤器进行。4.如权利要求1所述的一种提取细胞核的方法，其特征在于，步骤2)中所述第一离心处理是在4℃、500g的条件下进行5min。5.如权利要求1所述的一种提取细胞核的方法，其特征在于，步骤3)中所述第一重悬处理中一号缓冲液(WB)的用量为0.5mL。6.如权利要求1所述的一种提取细胞核的方法，其特征在于，步骤4)中所述第二离心细胞核沉淀在0.2mL的所述三号缓冲液(NB)进行所述第二重悬混匀处理。7.一种提取离体冰冻肿瘤组织的细胞核的方法，基于所述权利要求1所述的提取细胞核的方法，所述提取离体冰冻肿瘤组织的细胞核的方法包括：步骤A1，所述第二缓冲液预先经过4℃预冷处理，将所述离体冰冻肿瘤组织在所述第二缓冲液(LB)中进行机械破碎处理，所述离体冰冻肿瘤组织与所述第二缓冲液的质量体积比为不超过5mg:0.5mL，机械破碎处理后的所述离体冰冻肿瘤组织体积≤0.2mm3，将机械破碎处理产物冰置处理5～10min，利用移液枪混匀；然后将冰置处理产物进行10～15次吹打处
理，获得吹打处理产物；步骤A2，将步骤A1获得的所述吹打处理产物进行第一过滤处理，第一过滤...

【专利技术属性】
技术研发人员：王慧，何牮，孟梅，刘宁宁，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院，
类型：发明
国别省市：