高产雅槛蓝醇型倍半萜的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种高产雅槛蓝醇型倍半萜的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。该菌株为菌株CR

【技术实现步骤摘要】
高产雅槛蓝醇型倍半萜的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及代谢工程和植物抗病领域，特别涉及一种高产雅槛蓝醇型倍半萜的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]植物生长的环境中存在大量的病原微生物，其中的真菌类病原菌往往给植物的生长和产量产生严重的威胁，特别是在农业和中草药种植领域，真菌性病害造成的损失不可估量。立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)为无孢科、丝核菌属半知菌真菌，是一种土传病原菌，可引起很多农作物的枯萎病以及中药材的立枯病，包括水稻(Kouzai Y,Kimura M,Watanabe M et al.Salicylic acid-dependent immunity contributes to resistance against Rhizoctonia solani,a necrotrophic fungal agent of sheath blight,in rice and Brachypodium distachyon.New Phytologist,2008,217:771-783)、玉米(Gonz
á
lez-Vera AD,Bernardes-de-Assis J,Zala M et al.Divergence between sympatric rice-and maize-infecting populations of Rhizoctonia solani AG-1IA from Latin America.Phytopathology,2010,100:172-182)、半夏(范刚强，金义兰，桑维钧等.贵州省半夏常见病害种类调查与鉴定初报.山地农业生物学报,2009,28:312-316)、白车轴草(孙慧颖，杨丽娜，谢昀烨，万丹凤等.白车轴草夏枯病菌的生物学特性及药剂敏感性.吉林农业大学学报,2016,38:151-157)、红景天(白庆荣，谢昀烨，姜旭宇等.高山红景天立枯病菌菌丝融合群鉴定及药剂敏感性.东北林业大学学报,2014,1:107-111)等。尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是一种世界性分布的病原真菌，寄主范围广泛，被列为植物十大真菌病害之一(Dean R,Van Kan JAL,Pretorius ZA et al.The top 10fungal pathogens in molecular plant pathology.Molecular Plant Pathology,2012,13:414-430)，可引起农作物的枯萎病和中药材的根腐病，包括棉花(Liu N,Zhang X,Sun Y et al.Molecular evidence for the involvement of a polygalacturonase-inhibiting protein,GhPGIP1,in enhanced resistance to Verticillium and Fusarium wilts in cotton.Scientific Reports,2017,7:39840)、亚麻(Dmitriev AA,Krasnov GS,Rozhmina TA et al.Differential gene expression in response to Fusarium oxysporum infection in resistant and susceptible genotypes of flax(Linum usitatissimum L.).BMC Plant Biology,2017,17:253)、太子参(林茂兹，黄少华，陈巧巧等.太子参连作障碍及其根际土壤尖孢镰刀菌数量变化.云南农业大学学报,2012,27:716-721)、丹参(杨立，缪作清，杨光等.丹参枯萎病及其病原菌的研究.中国中药杂志,2013,38:4040-4043)等也都很容易被尖孢镰刀菌侵染，引起根腐病。由此可见，在农业和中草药种植行业，加强对病原真菌的防治是至关重要的。
[0003]植物源农药是来源于植物体的农药，包括植物自身以及从中提取的活性成分和按活性结构合成的化合物及衍生物(张鹏，李西文，董林林等.植物源农药研发及中药材生产
中的应用现状.中国中药杂志,2016,41:3579-3586)，是极具有潜力和市场的生物农药。我国药用植物资源丰富，品种繁多，很多中草药中含有抑制植物病原真菌的活性化合物，是开发植物源杀真菌农药的理想来源。迄今为止，已经有许多学者在药用植物抑制植物病原真菌方面进行了大量的研究，如银杏的种皮提取物能够对水稻纹枯病的致病真菌立枯丝核菌产生抗性(Oh TS,Koo HM,Yoon HR et al.Antifungal action of Ginkgo biloba outer seedcoat on rice sheath blight.Plant Pathology Journal,2016,31:61-66)；灵芝的甲醇提取物能够抑制链格孢霉菌(Aspergillus niger)、青霉菌(Penicillium sp.)、黑曲霉菌、尖孢镰刀菌的生长(Baig MN,Shahid AA,Ali M.In vitroassessment of extracts of the Lingzhi or Reishi medicinal mushroom,Ganoderma lucidum(higher basidiomycetes)against different plant pathogenic fungi.International Journal of Medicine Mushrooms,2015,17:407-11)；续断的根中分离得的甾醇、皂苷等化合物能够对包括稻瘟病菌、立枯丝核菌、灰霉菌、炭疽病菌在内的真菌病原菌产生抗性，其中的皂苷类物质被认为可以作为抗真菌的先导化合物(Choi NH,Jang JY,Choi GJ et al.Antifungal activity of sterols and dipsacus saponins isolated from Dipsacus asper roots against phytopathogenic fungi.Pesticide Biochemistry and Physiology,2017,141:103-108)。
[0004]目前，针对农作物和中药材的真菌性病害的防止主要依靠化学农药，但化学农药环境污染严重，农药残留严重，制约着我国粮食的生产安全以及中药的国际化进展。因此，开发使用具有绿色环保、无残留的植物源农药成为必然的选择。

技术实现思路

[0005]本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种高产雅槛蓝醇型倍半萜的酿酒酵母工程菌。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供所述高产雅槛蓝醇型倍半萜的酿酒酵母工程菌的构建方法。
[0007]本专利技术的又一目的在于提供所述高产雅本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高产雅槛蓝醇型倍半萜的酿酒酵母工程菌，其特征在于：为菌株CR-1和CR-2中的至少一种；所述菌株CR-1以酿酒酵母为出发菌株，敲除LPP1、DPP1和GDH1基因，过表达ERG8、ERG10、tHMG1、ERG12、ERG13、ERG19、IDI1、UPC2-1、CrTPS18和SmFPPS基因；其中，tHMG1和UPC2-1基因整合到酿酒酵母染色体TY3位点；IDI1和SmFPPS基因整合到酿酒酵母染色体TY4位点；ERG8、ERG10、ERG12、ERG13和ERG19基因整合到酿酒酵母染色体HIS3位点；CrTPS18基因整合到酿酒酵母染色体NDT80位点；所述菌株CR-2以菌株CR-1为出发菌株，将CrCYP71D349和AtCPR1整合到酿酒酵母染色体Gal80位点；所述的UPC2-1基因为UPC2基因第888位的Gly突变为Asp得到的UPC2-1基因。2.根据权利要求1所述的高产雅槛蓝醇型倍半萜的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述的ERG8、ERG10、tHMG1、ERG12、ERG13、ERG19和IDI1基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1～7所示；所述的UPC2-1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述的CrTPS18基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；所述的CrCYP71D349基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述的AtCPR1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；所述的SmFPPS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示。3.根据权利要求1所述的高产雅槛蓝醇型倍半萜的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述敲除LPP1、DPP1和GDH1基因为运用CRISPR-Cas9基因敲除系统进行基因敲除，具体步骤如下：(A)将LPP1、DPP1和GDH1基因的crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.24通过限制性内切酶Bsa Ι连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT-1；(B)将重组质粒pCRCT-1转化酿酒酵母，经过培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株；步骤(B)中所述的酿酒酵母为酿酒酵母BY4741；步骤(B)中所述的筛选为通过SD-URA缺陷培养基进行筛选。4.根据权利要求1所述的高产雅槛蓝醇型倍半萜的酿酒酵母工程菌，其特征在于：所述的酿酒酵母为酿酒酵母BY4741。5.权利要求1～4任一项所述的高产雅槛蓝醇型倍半萜的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)基因敲除：将LPP1、DPP1和GDH1基因的crRNA spacer核酸序列SEQ ID NO.24通过限制性内切酶Bsa Ι连接到pCRCT载体上，得到重组质粒pCRCT-1；然后将重组质粒pCRCT-1转化酿酒酵母BY4741，经过培养筛选，得到敲除LPP1、DPP1和GDH1基因的菌株BY4741-1；(2)利用重叠PCR构建以下10个模块：(a)将ERG8、P
TDH2
和T
PYX212
重叠，构建基因表达模块P
TDH2-ERG8-T
PYX212
，命名为模块I；(b)将ERG10、P
PGK1
和T
ADH1
重叠，构建基因表达模块P
PGK1-ERG10-T
ADH1
，命名为模块II；
(c)将ERG12、P
TDH3
和T
TDH2
重叠，构建基因表达模块P
TDH3-ERG12-T
TDH2
，命名为模块III；(d)将ERG13、P
TEF1
和T
CYC1
重叠，构建基因表达模块P
TEF1-ERG13-T
CYC1
，命名为模块IV；(e)将ERG19、P
TPI1
和T
FBA1
重叠，构建基因表达模块P
TPI1-ERG19-T
FBA1
，命名为模块V；(f)将CrTPS18、P
TPI1
和T
FBA1
重叠，构建基因表达模块P
TPI1-CrTPS18-T
FBA1
，命名为模块VI；(g)将CrCYP71D349、P
PGK1
和T
ADH1
重叠，构建基因表达模块P
PGK1-CrCYP71D349-T
ADH1
，命名为模块VII；(h)将AtCPR1、P
TEF1
和T
CYC1
重叠，构建基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：訾佳辰，安天悦，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：