用于心肌病的AAV心脏基因治疗制造技术

本发明专利技术涉及可用于治疗心脏病症的组合物和方法。所公开的组合物和方法基于包含用于将两个或更多个转基因递送到对象的心脏中的重组AAV载体的AAV治疗，其中所述转基因包含S100家族蛋白和凋亡抑制因子。在一些方面中，对一种或更多种心脏病症的多个来源进行的靶向可在治疗期间提供协同益处。在治疗期间提供协同益处。在治疗期间提供协同益处。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于心肌病的AAV心脏基因治疗
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2018年6月8日提交的美国临时申请No.62/682,772和于2019年3月21日提交的美国临时申请No.62/822,015的申请日的权益，其各自的全部内容通过引用并入。

技术介绍

[0003]扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是狗中心脏病的第二最常见原因，并且继发体征的医学管理是唯一的治疗选择。患病狗的预后取决于疾病的阶段和品种。杜宾犬(Doberman pinscher)一旦发生充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)就表现出特别迅速且一致的进展，大多数存活少于6个月。扩张型心肌病(DCM)是人心肌病的最常见类型，主要发生在20至60岁的成年人中。其影响心脏的心室和心房(分别为心脏的下腔和上腔)。DCM的大多数形式是来自多种原因的获得性形式，其包括使心肌发炎的冠心病、心脏病发作、高血压、糖尿病、甲状腺疾病、病毒性肝炎和病毒性感染。酒精滥用和某些药物(例如可卡因和安非他明)以及至少两种用于治疗癌症的药物(多柔比星和柔红霉素)也可导致DCM。另外，DCM有多种遗传形式，包括但不限于与迪谢内肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)和贝克肌营养不良(Becker muscular dystrophy)相关的DCM。在贝克肌营养不良的某些形式的情况下，以及在迪谢内肌营养不良的大多数情况下，心肌病最终可限制患者的存活。
[0004]专利技术概述
[0005]心肌病是对象中心脏病的第二最常见原因，并且继发体征的医学管理是唯一的治疗选择。患病对象的预后取决于疾病的阶段和品种。心脏功能严重依赖于钙依赖性信号传导。在心脏病期间，心脏细胞内钙通道的功能失常促进钙循环异常，进一步抑制心脏功能。已显示降低钙循环异常的基因转移策略在小型和大型动物模型中以及在人临床试验中改善心脏病。
[0006]在人中，扩张型心肌病是心肌病的最常见类型，并且可来源于多种获得性以及遗传性病症。如在狗和其他动物模型中一样，虽然疾病起因的根源在于钙处理功能障碍，但疾病的最终进展是由线粒体功能障碍和/或牵张诱导的心肌细胞凋亡所驱动的。尽管在早期疾病阶段仅仅解决钙处理问题就可以是有效的，但解决钙处理、线粒体功能障碍和凋亡的组合对于治疗DCM的所有形式以及在疾病进展的所有阶段都是必要的。
[0007]本文中公开了用于治疗患有心肌病和充血性心力衰竭的对象的基因递送方法。这些方法包括：表达S100A1以解决钙处理，以及表达ARC(胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(Apoptosis Repressor with Caspase Recruitment Domain))以阻断所有凋亡来源并使线粒体功能正常化。通过所公开的自互补AAV载体方法表达S100A1和ARC转基因是迅速的(即，在数小时内)，这对抵消终末期心力衰竭的影响是至关重要的并且限于心脏。因此，这些方法解决了DCM发作和进展的所有三个驱动因素，并且因此应适用于在疾病进展的任何阶段的任何DCM形式。
[0008]本公开内容的一些方面提供了用于将转基因递送到对象的心脏中的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)载体。在一些实施方案中，这样的rAAV载体包含至少两个转基因，一个编码S100家族蛋白，并且一个编码凋亡抑制因子(apoptotic inhibitor)。这样的rAAV载体可从5
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至3
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依次包含：第一腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)反向末端重复(inverted terminal repeat，ITR)序列、可操作地连接至转基因的启动子和第二AAV反向末端重复(ITR)序列。在一些实施方案中，两个转基因可操作地连接至同一个单启动子。在另一些实施方案中，每个转基因可操作地连接至单独的启动子。在一些实施方案中，rAAV载体还包含至少一个多腺苷酸化信号(例如，在从单启动子表达的两个转基因的3
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，或在从不同启动子表达的一个或两个转基因的3
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)。本公开内容的一些方面提供了用于将两个或更多个转基因递送到对象的心脏中的重组腺相关病毒(rAAV)核酸载体，其中所述载体从5
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至3
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依次包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列、两个或更多个转基因和可操作地连接至所述两个或更多个转基因的启动子、多腺苷酸化信号以及第二AAV反向末端重复(ITR)序列，其中所述两个或更多个转基因包含S100家族蛋白和凋亡抑制因子。
[0009]本公开内容的转基因可以是S100家族蛋白和凋亡抑制因子。例如，S100家族蛋白是心脏S100钙结合蛋白A1(cS100A1)或其变体。在另一个实例中，凋亡抑制因子是心脏胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(cardiac Apoptosis Repressor with Caspase Recruitment Domain，cARC)或其变体。
[0010]在一些实施方案中，本公开内容的一个或更多个转基因是天然存在的序列。在一些实施方案中，一个或更多个转基因被改造为物种特异性的。在一些实施方案中，对一个或更多个转基因进行密码子优化用于在目的物种(例如，犬)中表达。在某些实施方案中，一个或更多个转基因(例如cARC转基因)是经密码子优化的。
[0011]在一些实施方案中，在两个或更多个转基因之间(例如，在cS100A1转基因和cARC转基因之间)存在内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site，IRES)。在一些实施方案中，编码S100家族蛋白的转基因在编码凋亡抑制因子的转基因的5
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。在另一些实施方案中，编码凋亡抑制因子的转基因在编码S100家族蛋白的转基因的5
’
。
[0012]在一些实施方案中，启动子是心脏限制性启动子。心脏限制性启动子可以是来自以下基因之一的启动子：α-肌球蛋白重链基因、6-肌球蛋白重链基因、肌球蛋白轻链2v基因、肌球蛋白轻链2a基因、CARP基因、心脏α-肌动蛋白基因、心脏m2毒蕈碱型乙酰胆碱基因(muscarinic acetylcholine gene)、ANF、心脏肌钙蛋白C、心脏肌钙蛋白I、心脏肌钙蛋白T(cTnT)、心脏肌质网Ca-ATP酶基因、骨骼α-肌动蛋白；或来源于MLC-2v基因的人工心脏启动子(artificial cardiac promoter)。在一些实施方案中，心脏限制性启动子是cTnT启动子。
[0013]本文中还提供了rAAV颗粒，其包含被衣壳化(encapsidated)在AAV衣壳中的本文中所公开的rAAV载体。在一些实施方案中，AAV衣壳包含来源于AAV1、AAV2、AAV3、AAV6、AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，AAV衣壳包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.用于将两个或更多个转基因递送到对象的心脏中的重组腺相关病毒(rAAV)核酸载体，其中所述载体从5
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至3
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依次包含：第一腺相关病毒(AAV)反向末端重复(ITR)序列、两个或更多个转基因和可操作地连接至所述两个或更多个转基因的启动子、多腺苷酸化信号、以及第二AAV反向末端重复(ITR)序列，其中所述两个或更多个转基因包含S100家族蛋白和凋亡抑制因子。2.权利要求1所述的rAAV载体，其中所述S100家族蛋白是心脏S100钙结合蛋白A1(cS100A1)或其变体。3.权利要求1或2所述的rAAV载体，其中所述凋亡抑制因子是心脏胱天蛋白酶募集域凋亡抑制因子(cARC)或其变体。4.权利要求2或3所述的rAAV载体，其中在cS100A1转基因和cARC转基因之间存在内部核糖体进入位点(IRES)。5.权利要求1至4中任一项所述的rAAV载体，其中所述转基因是物种特异性的。6.权利要求1至5中任一项所述的rAAV载体，其中所述启动子是心脏限制性启动子。7.权利要求6所述的rAAV载体，其中所述心脏限制性启动子选自以下基因：α-肌球蛋白重链基因、6-肌球蛋白重链基因、肌球蛋白轻链2v基因、肌球蛋白轻链2a基因、CARP基因、心脏α-肌动蛋白基因、心脏m2毒蕈碱型乙酰胆碱基因、ANF、心脏肌钙蛋白C、心脏肌钙蛋白I、心脏肌钙蛋白T(cTnT)、心脏肌质网Ca-ATP酶基因和骨骼α-肌动蛋白；以及来源于MLC-2v基因的人工心脏启动子。8.权利要求6或7所述的rAAV载体，其中所述心脏限制性启动子是cTnT。9.rAAV颗粒，其包含被衣壳化在AAV衣壳中的权利要求1至8中任一项所述的rAAV载体。...

【专利技术属性】
技术研发人员：休，
申请(专利权)人：佛罗里达大学研究基金会有限公司，
类型：发明
国别省市：