提高枯草芽孢杆菌GlcNAc产量的方法及一种重组枯草芽孢杆菌技术

本发明专利技术公开了一种提高枯草芽孢杆菌GlcNAc产量的方法及一种重组枯草芽孢杆菌，属于基因工程技术领域。本发明专利技术以枯草芽孢杆菌作为出发菌株，通过基于Gibson组装技术，以强组成型启动子P

【技术实现步骤摘要】
提高枯草芽孢杆菌GlcNAc产量的方法及一种重组枯草芽孢杆菌


[0001]本专利技术涉及一种提高枯草芽孢杆菌GlcNAc产量的方法及一种重组枯草芽孢杆菌，属于基因工程


技术介绍

[0002]氨基葡萄糖(Glucosamine)是一种重要的功能单糖，其衍生物N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine)，也称2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖，是葡萄糖2位羟基被乙酰氨基(CH3CONH-)取代后的单糖衍生物。作为自然界中仅次于纤维素的第二大碳水化合物甲壳素的单体，乙酰氨基葡萄糖大量存在于原核、真核、植物的细胞壁以及动物的骨骼之中。
[0003]研究表明，氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖具有一些特殊的生理活性功能，如消炎镇痛，修复软骨损伤，治疗风湿性关节炎；强化白细胞增值和分化，促进细胞因子分泌，改善免疫调节、抗肿瘤；恢复线粒体内酶表达，提高线粒体谷胱甘肽抗氧化能力，增强免疫功能；促进内质网相关蛋白降解，强化蛋白酶活性，改善蛋白稳态水平，延长细胞寿命等。因此，其被广泛应用于医药、食品营养、健康保健及化妆品等领域。据报道，2019年全球氨基葡萄糖市场总额约为50亿美元。随着生活质量的进一步提高以及人口老龄化问题的加剧，氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖类医药、食品营养保健品的全球需求会持续增加。预计在2019到2022年之间，氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖的全球市场规模会以 5％的复合年均增长率(Compound annual growth rate，CAGR)上升。
[0004]用于微生物发酵法生产GlcNAc的工程菌株主要包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。以E.coli作为GlcNAc生产宿主，通过代谢工程手段改造优化后产量能达到110g
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L-1
。然而，E.coli是非食品安全级菌株，分泌的内毒素导致其生产的GlcNAc无法应用于食品、医药等领域。C.glutamicum和S.cerevisiae是食品安全级菌株，但目前两者报道的 GlcNAc产量皆较低，分别为2.1和6.9g
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。而且，C.glutamicum属于非模式菌株，基因组GC含量较高，且遗传背景和分子操作技术尚不成熟，导致基因操作较难。相比之下，B.subtilis具有遗传背景清晰，分子操作技术成熟的特点。
[0005]针对B.subtilis合成乙酰氨基葡萄糖国内外已开展了大量的代谢工程改造工作，但是B.subtilis合成乙酰氨基葡萄糖胞内代谢网络及调控机制仍未清晰理解，比如乙酰氨基葡萄糖的转运蛋白。B.subtilis合成乙酰氨基葡萄糖的产量有待进一步提高。

技术实现思路

[0006]为解决上述问题，本专利技术提供一种提高枯草芽孢杆菌GlcNAc产量的方法，通过在枯草芽孢杆菌中过表达二氢脂酰胺乙酰转移酶编码基因acoC，能够提高乙酰氨基葡萄糖产量，在代谢工程上具有良好的应用前景。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种提高枯草芽孢杆菌GlcNAc产量的方法，所述方法
是通过在生产乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌中过表达二氢脂酰胺乙酰转移酶编码基因acoC。
[0008]进一步地，所述的二氢脂酰胺乙酰转移酶编码基因acoC通过强组成型导型启动子P
43
调控表达。
[0009]进一步地，所述的二氢脂酰胺乙酰转移酶编码基因acoC序列如SEQ IDNO.1所示。
[0010]进一步地，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌B.subtilis 168 ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagA ΔnagB Δldh P
xylA-glmS ΔglcK ΔpyK ΔkdgA ΔpckA P
43-pfkAP
43-fbaA P
43-pckA ΔmelA ΔmalS ΔywkA ΔytsJ P
43-bacpycA P
43-glmS P
43-glnAP
43-gltC P
43-EcglnA P
43-bmqO P
43-porAB P
43-gor P
43-nifH::lox72(枯草芽孢杆菌 BP18)。
[0011]枯草芽孢杆菌BP18的构建方法可参阅文献“Synthetic redesign of centralcarbon and redox metabolism for high yield production of N-acetylglucosamine inBacillus subtilis(Metabolic Engineering，51(2019)p59-69)”，在此不作进一步描述。
[0012]本专利技术的第二个目的是提供采用所述的方法构建得到的重组枯草芽孢杆菌。
[0013]进一步地，所述的重组枯草芽孢杆菌是以强组成型启动子P
43
调控枯草芽孢杆菌中二氢脂酰胺乙酰转移酶编码基因acoC的表达得到。
[0014]本专利技术的第三个目的是提供所述的重组枯草芽孢杆菌发酵生产乙酰氨基葡萄糖的方法，包括以下步骤：将重组枯草芽孢杆菌在种子培养基中活化，然后将活化后的种子转入发酵培养基，加入诱导剂进行发酵培养，得到乙酰氨基葡萄糖。
[0015]进一步地，所述的种子培养基包括以下成分：8-12g/L胰蛋白胨、4-6g/L 酵母粉和8-12g/L氯化钠。
[0016]进一步地，所述的发酵培养基包括以下成分：18-22g/L葡萄糖、5-7g/L蛋白胨、10-14g/L酵母粉、5-7g/L硫酸铵、10-14g/L磷酸氢二钾、2-3g/L磷酸二氢钾、4-6g/L碳酸钙和8-12ml/L微量元素溶液。
[0017]进一步地，所述的微量元素溶液包括以下成分：0.8-1.2g/L硫酸锰、0.3-0.5 g/L氯化钴、0.1-0.3g/L钼酸钠、0.1-0.3g/L硫酸锌、0.05-0.15g/L氯化铝、 0.05-0.15g/L氯化铜、0.04-0.06g/L硼酸和4-6mol/L盐酸。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]本专利技术以枯草芽孢杆菌作为出发菌株，通过基于Gibson组装技术，以强组成型启动子P
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调控二氢脂酰胺乙酰转移酶编码基因acoC表达，从而能够提高枯草芽孢杆菌中乙酰氨基葡萄糖产量，重组枯草芽孢杆菌BP18-GNA1-acoC的乙酰氨基葡萄糖产量达到26.8g
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，较对照菌BP18-GNA1(24.5g
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)提高9.4％。本专利技术加强乙酰氨基葡萄糖合成途径，为进一步代谢工程改造枯草芽孢杆菌生产氨基葡萄糖奠定了基础。本专利技术提供的重组枯草芽孢杆菌构建本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高枯草芽孢杆菌GlcNAc产量的方法，其特征在于，所述方法是通过在生产乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌中过表达二氢脂酰胺乙酰转移酶编码基因acoC。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二氢脂酰胺乙酰转移酶编码基因acoC通过强组成型导型启动子P
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调控表达。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二氢脂酰胺乙酰转移酶编码基因acoC序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌B.subtilis 168ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagA ΔnagB Δldh P
xylA-glmS ΔglcK ΔpyK ΔkdgA ΔpckA P
43-pfkA P
43-fbaA P
43-pckA ΔmelA ΔmalS ΔywkA ΔytsJ P
43-bacpycA P
43-glmS P
43-glnA P
43-gltC P
43-EcglnA P
43-bmqO P
43-porAB P
43-gor P
43-nifH::lox72。5.一种采用权利要求1-4任一...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，卢健行，堵国成，李江华，吕雪芹，刘长峰，顾洋，房峻，
申请(专利权)人：山东润德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：