一种脂蛋白a检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种脂蛋白a检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和校准品，其特征在于，所述的试剂R1包括第一缓冲液50～250mmol/L、抗干扰剂1～2wt％、促进剂1～2.5wt％、防腐剂0.01～0.1wt％；所述的试剂R2包括第二缓冲液50～250mmol/L、稳定剂0.5～5wt％、抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒0.1～2g/L、防腐剂0.02～0.2wt％。采用本发明专利技术的检测试剂盒可以消除疏水作用、补体、类风湿性因子等因素引致的非特异性干扰的问题，具有抗干扰能力强、特异性高、准确度高、稳定性好等优点，并且操作方便、便于推广应用。便于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种脂蛋白a检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及体外诊断试剂
，具体涉及一种脂蛋白a检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]脂蛋白(a)即lipoprotein(a)，是一种由肝脏合成的富含胆固醇的特殊大分子脂蛋白，它由一个脂质核心、apoB-100分子、以及其外围的亲水性的apo(a)三部分组成。主要在肝脏合成后分泌入血，在致动脉粥样硬化过程中起着极其重要的作用。脂蛋白(a)与冠心病、钙化性主动脉瓣狭窄、家族性高胆固醇血症、外周血管疾病等密切相关，并已成为公认的冠心病独立预测因子。
[0003]目前，已知的检测脂蛋白(a)浓度的方法有酶联免疫吸附法，放射免疫法，免疫比浊法等检测方法，这些方法均存在一定的缺点。如：放射免疫法有放射性污染；酶联免疫吸附法操作复杂、耗时长，对操作者有一定的技能要求；免疫比浊法与纤溶酶原有交叉污染，因此测定的准确度也就比较低，需要进行改进。胶乳颗粒增强免疫比浊法是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法，其原理是：在高分子胶乳微球的表面交联单克隆或多克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能，反应液透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。
[0004]研究表明，采用胶乳颗粒增强免疫比浊法进行检测会受到多种因素的干扰而产生假阳性结果，如：1)反应环境中存在的疏水性物质会与抗原/抗体或胶乳通过疏水作用结合，导致胶乳颗粒增强免疫比浊法检测脂蛋白(a)时产生假阳性；2)血清和组织液中的补体分子会与抗体的Fc段和C1q补体结合位点结合，而产生假阳性；3)血清中类风湿性因子与包被或标记的抗体的Fc段结合产生假阳性结果。
[0005]虽然现有技术针对脂蛋白(a)含量的检测已经研发不少基于胶乳颗粒增强免疫比浊法原理的检测试剂盒，如专利公开号为CN 103149370 A、CN106990234 A、CN 107607729 A、CN 111239422 A、CN 109541241 A等中国专利技术专利，但上述的专利并没有解决体外诊断试剂中疏水作用、补体、类风湿性因子等因素引致的非特异性干扰的问题。
[0006]另一方面，现有技术制备的抗体包被胶乳颗粒稳定性较差，将抗体偶联至羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒，即时检测效果很好，但是置于37℃2天后，抗体活性下降较大，且胶乳发生凝集现象，导致试剂盒使用的重复性不好、变异系数增大，直接导致试剂检测结果不准确，不能满足使用要求。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种脂蛋白a检测试剂盒及检测方法，采用该检测试剂盒可以消除疏水作用、补体、类风湿性因子等因素引致的非特异性干扰的问题，具有抗干扰能力强、特异性高、准确度高、稳定性好等优点，并且操作方便、便于推广应用。
[0008]本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：
[0009]一种脂蛋白a检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和校准品，其特征在于，所述的试剂R1包括第一缓冲液50～250mmol/L、抗干扰剂1～2wt％、促进剂1～2.5wt％、防腐剂0.01～0.1wt％；所述的试剂R2包括第二缓冲液50～250mmol/L、稳定剂0.5～5wt％、抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒0.1～2g/L、防腐剂0.02～0.2wt％。
[0010]优选地，所述的第一缓冲液、第二缓冲液各自独立地选自MOPS缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的至少一种。所述的缓冲溶液的pH值范围为：6.5～8.5。
[0011]优选地，所述的抗干扰剂为麦角硫因(L-Ergothioneine，EGT，化学名为2-巯基组氨酸三甲基内盐)和TCEP-HCl(三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐)以1:(1～2)的质量比组成。
[0012]更优选地，所述的抗干扰剂为麦角硫因和TCEP-HCl以1:1.5的质量比组成。
[0013]优选地，所述的稳定剂选自甘露寡聚糖、羧甲基葡聚糖、蔗糖、海藻糖、甘油、甘露醇、山梨醇中的至少一种。
[0014]更优选地，所述的稳定剂为甘露寡聚糖和甘油以质量比1:(2～4)的质量比组成。
[0015]优选地，所述的促进剂为聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、吐温-20或吐温-80。
[0016]优选地，所述的防腐剂为Proclin300或NaN3。
[0017]优选地，所述的抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒中抗人脂蛋白a单克隆抗体和胶乳颗粒共价结合，采用化学交联法将单克隆抗体包被于胶乳颗粒中。其中，抗人脂蛋白a单克隆抗体为羊抗人、鼠抗人或兔抗人脂蛋白a单克隆抗体；胶乳颗粒为表面带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒，颗粒的粒径为50～300nm。优选地，所述的胶乳颗粒中粒径为50nm、100nm、300nm的胶乳颗粒的占比(质量比)分别为：2:3:1。
[0018]所述的抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒采用常规的化学交联法进行制备，具体步骤为：
[0019](1)制备抗人脂蛋白a抗体溶液：取抗人脂蛋白a单克隆抗体溶于Tris-HCl缓冲液中，pH为7.2，制得浓度为1.0mg/mL的抗人脂蛋白a抗体溶液；
[0020](2)制备胶乳微球悬浮液：取表面带有羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒溶解于Tris-HCl缓冲液中，浓度为1％(w/v)，加入终浓度为50mg/mL NHS和100mM EDAC，室温下孵育30min，离心(15000rpm,30min)，弃上清，用相同体积的Tris-HCl缓冲液洗涤胶乳微球两次，去除多余的交联剂，加入Tris-HCl缓冲液，震荡重悬，制得浓度为1％(w/v)的胶乳微球悬浮液；
[0021](3)制备抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒：将步骤(1)得到的抗人脂蛋白a抗体溶液和步骤(2)得到的胶乳微球悬浮液按体积比1:1混匀，37℃孵育3h，每mL反应液中加入2mL乙醇胺混匀，37℃封闭30min，离心(15000rpm,30min)，弃上清，用相同体积的Tris-HCl缓冲液洗涤两次，去除未结合的抗体，加入Tris-HCl缓冲液，震荡重悬，得到抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒。
[0022]本专利技术还提供一种用于非疾病诊断治疗目的的利用上述的试剂盒检测脂蛋白a含量的方法，该方法包括以下步骤：
[0023](1)取待测样品，加入所述试剂R1，反应4～6min后，加入所述试剂R2混匀，读取吸光度A1，继续反应4～6min后，读取吸光度A2，计算ΔA＝A2-A1；
[0024](2)使用所述脂蛋白a校准品绘制标准曲线，并根据ΔA和标准曲线得到待测样品
中脂蛋白a的含量。
[0025]优选地，上述的检测方法中，所述的待测样品、试剂R1和试剂R2的体积比为2:(120～180):(30～60)，反应温度为37℃，检测波长为600nm。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种脂蛋白a检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和校准品，其特征在于，所述的试剂R1包括第一缓冲液50～250mmol/L、抗干扰剂1～2wt％、促进剂1～2.5wt％、防腐剂0.01～0.1wt％；所述的试剂R2包括第二缓冲液50～250mmol/L、稳定剂0.5～5wt％、抗人脂蛋白a单克隆抗体包被胶乳颗粒0.1～2g/L、防腐剂0.02～0.2wt％。2.根据权利要求1所述的脂蛋白a检测试剂盒，其特征在于，所述的第一缓冲液、第二缓冲液各自独立地选自MOPS缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、Tris-HCl缓冲液中的至少一种。3.根据权利要求1所述的脂蛋白a检测试剂盒，其特征在于，所述的抗干扰剂为麦角硫因和TCEP-HCl以1:(1～2)的质量比组成。4.根据权利要求3所述的脂蛋白a检测试剂盒，其特征在于，所述的抗干扰剂为麦角硫因和TCEP-HCl以1:1.5的质量比组成。5.根据权利要求1所述的脂蛋白a检测试剂盒，其特征在于，所述的稳定剂选自甘露寡聚糖、羧甲基葡聚糖、蔗糖、海藻糖、甘油、甘露醇、山梨醇中的至少一种。6.根据权利要求5所述的脂蛋白a检测试剂盒，其特征在于，所述的稳定剂为...

【专利技术属性】
技术研发人员：黎法飓，
申请(专利权)人：黎法飓，
类型：发明
国别省市：