一种β2-GP1改构蛋白及其构建方法、应用技术

本发明专利技术公开了β2

【技术实现步骤摘要】
一种
β
2-GP1改构蛋白及其构建方法、应用


[0001]本专利技术涉及生物医药工程
，具体涉及一种β2-GP1改构蛋白及其构建方法、应用。

技术介绍

[0002]抗磷脂综合征(APS)为一种以反复动脉或者静脉血栓、病态妊娠和抗磷脂抗体(APL)持续阳性的疾患。抗磷脂抗体(APL)可同时导致多器官血管受累，表现为恶性高血压、轻度偏瘫、呼吸困难、肝梗死、心脏动脉血栓形成等症状。由于长期诊断困难，缺乏有效药物，患者死亡率高达75％以上。
[0003]抗磷脂综合征(APS)的分类必须满足至少一项临床(血管血栓形成或妊娠合并症)和一项实验室(抗心磷脂抗体，狼疮抗凝或抗β2-GP1抗体阳性)指标。
[0004]但是目前，在三种实验室标准的测试方法中，均显示出方法学缺陷，即成本过高、检测过程繁琐，敏感性和特异性差异较大，且为单一抗体检测，容易出现患者疾病漏检。
[0005]研究表明，抗磷脂抗体(APL)检测中双阳性(aCL+、aβ2-GP1+)结果的患者，显示出与血栓和病态妊娠的强关联，因此联合检测抗心磷脂抗体(aCL)和抗β2-GP1抗体具有重要的意义。
[0006]β2-GP1是一种由326个氨基酸残基组成的多肽链，分子量约为50KD，具有4个糖基化位点，为高度糖基化的单链亲水蛋白；因其参与脂肪的转运和代谢，又称载脂蛋白H(Apolipoprotein H)。β2-GP1由5个从N末端编号为1-5的同源域组成。结构域1到结构域4由约60个氨基酸组成，这些氨基酸包含有同一个基序，该基序的特征是四个保守的半胱氨酸残基组成的框架。第5结构域与结构域1-4的不同之处在于，它含有6个Cys，组成3个内部二硫键，并且有一个不规则较长的C末端尾部，含有高度正电荷序列Cys281-Cys288和进化保守的疏水序列亮氨酸(Leu)313-色氨酸(Trp)316，为磷脂结合的关键部位，因此β2-GP1呈现强的亲脂特性。在中性pH条件下，第5结构域能与阴性磷脂(PL)稳定结合。
[0007]研究发现，在β2-GP1的5个结构域中，结构域1(D1)为抗β2-GP1抗体的特异性识别位点。另外，当β2-GP1结合心磷脂后形成的磷脂-蛋白复合物，这一种磷脂-蛋白复合物，将暴露出其中的结构域4(D4)的隐性表位，被β2-GP1依赖性抗心磷脂抗体(aCL)所识别，而这一种抗心磷脂抗体才有病理意义，成为β2-GP1依赖性抗心磷脂抗体(aCL)的抗原。

技术实现思路

[0008]本专利技术目的在于提供β2-GP1改构蛋白，通过将D1、D4和D5结构域通过一定的氨基酸序列进行链接，形成一种能特异性结合抗β2-GP1抗体和抗aCL抗体的改构蛋白，该改构蛋白用于试剂盒能增加试剂盒的特异性，实现抗β2-GP1抗体和抗aCL抗体的联检，提高APS的检出率。
[0009]此外，本专利技术还提供上述β2-GP1改构蛋白的构建方法、在试剂盒中的应用。
[0010]本专利技术通过下述技术方案实现：
[0011]一种β2-GP1改构蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0012]β2-GP1改构蛋白能够用于抗β2-GP1抗体和抗aCL抗体的同时检测，有助于提高检测试剂盒的灵敏度和准确度。
[0013]β2-GP1改构蛋白，包含结构域1蛋白区段、结构域4蛋白区段和结构域5蛋白区段。
[0014]一种编码β2-GP1改构蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0015]β2-GP1是一种由326个氨基酸残基组成的多肽链，分子量约为50KD，具有4个糖基化位点，为高度糖基化的单链亲水蛋白；因其参与脂肪的转运和代谢，又称载脂蛋白H(Apolipoprotein H)。β2-GP1由5个从N末端编号为1-5的同源域组成。结构域1到结构域4由约60个氨基酸组成，这些氨基酸包含有同一个基序，该基序的特征是四个保守的半胱氨酸残基组成的框架。第5结构域与结构域1-4的不同之处在于，它含有6个Cys，组成3个内部二硫键，并且有一个不规则较长的C末端尾部，含有高度正电荷序列Cys281-Cys288和进化保守的疏水序列亮氨酸(Leu)313-色氨酸(Trp)316，为磷脂结合的关键部位，因此β2-GP1呈现强的亲脂特性。在中性pH条件下，第5结构域能与阴性磷脂(PL)稳定结合。
[0016]在β2-GP1的5个结构域中，结构域1(D1)为抗β2-GP1抗体的特异性识别位点。另外，当β2-GP1结合心磷脂后形成的磷脂-蛋白复合物，这一种磷脂-蛋白复合物，将暴露出其中的结构域4(D4)的隐性表位，被β2-GP1依赖性抗心磷脂抗体(aCL)所识别，而这一种抗心磷脂抗体具有病理意义，成为β2-GP1依赖性抗心磷脂抗体(aCL)的抗原。
[0017]本专利技术的β2-GP1改构蛋白，删除结构域2和结构域3，可以使β2-GP1呈现出与全长序列表达所不同的构象，当连接一个心磷脂后，呈现出的抗原表位，既具有与β2-GP1依赖性抗心磷脂抗体和抗β2-GP1抗体结合的能力，用来制备试剂盒将减少试剂盒检测样本时的非特异性结合。
[0018]β2-GP1改构蛋白的构建方法，包括如下步骤：
[0019]S1、重组全基因合成序列：依次连接结构域1、结构域4、结构域5蛋白区段的核苷酸序列获得目的基因；
[0020]S2、构建重组质粒：将步骤S1中获得的重组全基因合成序列构建至表达载体，获得重组质粒；
[0021]S3、一次转染：将步骤S2中的重组质粒转染宿主细胞，获得重组杆粒；
[0022]S4、二次转染：将步骤S3中的重组杆粒再次转染宿主细胞，获得第一代的杆状病毒；
[0023]S5、表达：将步骤S4中的第一代的杆状病毒进行表达；
[0024]S6、获得改构蛋白：将步骤S5中表达得到的细胞培养物进行纯化，获得改构蛋白。
[0025]优选地，所述步骤S1重组全基因合成序列过程中包含一个单位的结构域1蛋白区段的核苷酸序列、一个单位的结构域4蛋白区段的核苷酸序列和一个单位的结构域5蛋白区段的核苷酸序列。
[0026]优选地，所述步骤S1中重组全基因合成序列中还包括柔性肽基因序列、真核KOZAK序列、蜂毒信号肽序列、Avi标签序列和His标签序列，真核KOZAK序列、蜂毒信号肽序列、结构域1蛋白区段的核苷酸序列、柔性肽基因序列、结构域4蛋白区段的核苷酸序列、柔性肽基因序列、结构域5蛋白区段的核苷酸序列、Avi标签序列和His标签序列依次相连。
[0027]本专利技术在结构域5上连接的Avi-tag(序列为GLNDIFEAQKIEWHE)是一个由15个氨基
酸残基组成的短肽标签，在体内或体外都能被生物素连接酶在赖氨酸残基连接上一个生物素，从而实现蛋白的生物素化，因此在制备试剂盒时，使用链酶亲和素磁珠可以轻易连接上本专利技术改构蛋白，在不影响线性表位的前提下增加偶联效率。
[0028]优选地，步骤S1中重组全基因合成序本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种β2-GP1改构蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。2.根据权利要求1所述的一种β2-GP1改构蛋白，其特征在于，包含结构域1蛋白区段、结构域4蛋白区段和结构域5蛋白区段。3.一种编码如权利要求1所述的一种β2-GP1改构蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。4.β2-GP1改构蛋白的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、重组全基因合成序列：依次连接结构域1、结构域4、结构域5蛋白区段的核苷酸序列获得目的基因；S2、构建重组质粒：将步骤S1中获得的重组全基因合成序列构建至表达载体，获得重组质粒；S3、一次转染：将步骤S2中的重组质粒转染宿主细胞，获得重组杆粒；S4、二次转染：将步骤S3中的重组杆粒再次转染宿主细胞，获得第一代的杆状病毒；S5、表达：将步骤S4中的第一代的杆状病毒进行表达；S6、获得改构蛋白：将步骤S5中表达得到的细胞培养物进行纯化，获得改构蛋白。5.根据权利要求4所述的一种β2-GP1改构蛋白的构建方法，其特征在于，所述步骤S1重组全基因合成序列过程中包含一个单位的结构域1蛋白区段的核苷酸序列、一个单位的结构域4蛋白区段的核苷酸序列和一个单位的结构域5蛋白区段的核苷酸序列。6.根据权利要求4所述的一种β2-GP1改构蛋白的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中重组全基因合成序列中还包括柔性肽基因序列、真核KOZAK序列、蜂毒信号肽序列、Avi标签...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦枫，姚俊腾，季纯宇，任伟超，张小飞，颜松，周玥，黄敬双，张伟，万文琴，鲜静，
申请(专利权)人：四川携光生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：