牛副流感病毒重组抗原及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种牛副流感病毒重组抗原及其应用，牛副流感病毒重组抗原包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的牛副流感病毒重组F蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的牛副流感病毒重组HN蛋白，且所述牛副流感病毒重组F蛋白和所述牛副流感病毒重组HN蛋白形成异二聚体。本发明专利技术以筛选的F蛋白和HN蛋白局部片段为基础，而非全长蛋白，且在F蛋白片段和HN蛋白片段的C端均添加了牛抗体Fc片段，从而使两个蛋白片段在一个细胞内同时表达时能够形成更稳定的异二聚体，并显著增加了蛋白的免疫原性。并显著增加了蛋白的免疫原性。并显著增加了蛋白的免疫原性。

【技术实现步骤摘要】
牛副流感病毒重组抗原及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物
，特别是涉及一种牛副流感病毒重组抗原及其应用。

技术介绍

[0002]牛副流感(Bovine parainfluenza，BP)是由牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV3)感染引起的牛急性接触性传染病。该病呈世界性分布，能够感染多种动物，包括牛、绵羊、山羊和野生反刍动物，也包括人类和非灵长人类。BPIV3主要引起成年牛、犊牛、羊羔和小山羊等的肺炎、支气管肺炎和被感染肺叶的实质性病变，在临床上主要表现为食欲不振、精神萎靡、发热、流泪、流涕和呼吸加快等。BPIV3感染对牛可渐进式地造成肺组织损伤和免疫抑制，在运输、受寒和饥饿等应激情况下可继发细菌或支原体感染，如多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、牛支原体等，从而引起严重的支气管肺炎，导致牛呼吸道疾病综合征(Bovine respiratory disease complex，BRDC)，死亡率大大增加。
[0003]BPIV3属副黏病毒亚科呼吸道病毒属，有囊膜结构，基因组为单股负链RNA，核酸全长约15kb。病毒基因组编码6种结构蛋白，其中核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、大分子蛋白(L)为一类，称为内部蛋白，这3种蛋白和病毒基因组RNA共同形成核糖核蛋白复合体RNPs，此核糖核蛋白复合体是病毒的核心成分，参与病毒RNA的转录与复制；囊膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶蛋白(HN)为一类，称为外部蛋白，其中M蛋白是构成囊膜的主要成分，HN蛋白、F蛋白分别构成了囊膜表面的大、小纤突，在病毒和宿主细胞吸附时起重要作用。F蛋白是由540个氨基酸组成的I型整合膜蛋白，在中性pH的条件下，以融合蛋白的形式在病毒包膜和宿主细胞质膜之间调控病毒的穿入，F蛋白同时作为保护性抗原能刺激机体产生中和抗体。HN蛋白位于病毒粒子的表面，是病毒主要的中和反应和保护性抗原，可以通过二硫键形成四聚体发挥其生物活性。
[0004]目前，预防BPIV3的疫苗以弱毒疫苗和灭活疫苗为主，一般的灭活疫苗虽然制造工艺简单，但免疫期限短、免疫效果差，弱毒疫苗能够诱导体液免疫和细胞免疫，但存在返毒的可能，使免疫牛成为潜在感染源。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要提供一种免疫期限较长、免疫效果较好的牛副流感病毒重组抗原。
[0006]一种牛副流感病毒重组抗原，包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的牛副流感病毒重组F蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的牛副流感病毒重组HN蛋白，且所述牛副流感病毒重组F蛋白和所述牛副流感病毒重组HN蛋白形成异二聚体。
[0007]本专利技术还提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有F基因和HN基因，所述F基因和所述HN基因分别编码所述牛副流感病毒重组F蛋白和所述牛副流感病毒重组HN蛋白。
[0008]在其中一个实施例中，所述F基因和所述HN基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
[0009]在其中一个实施例中，所述重组表达载体基于pSV2-GS、pCI-GS或pcDNA4-GS构建得到。
[0010]本专利技术还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有所述重组表达载体。
[0011]在其中一个实施例中，所述宿主细胞为DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞株。
[0012]本专利技术还提供了所述牛副流感病毒重组抗原、所述重组表达载体或所述宿主细胞在制备用于防治牛副流感的产品中的应用。
[0013]本专利技术还提供了一种牛副流感疫苗，包括所述牛副流感病毒重组抗原，以及药学上可接受的佐剂。
[0014]在其中一个实施例中，所述佐剂为MONTANIDE ISA 206VG、MONTANIDE ISA 201VG、液体石蜡、樟脑油和植物细胞凝集素中的一种或多种。
[0015]本专利技术还提供了一种所述牛副流感病毒重组抗原的制备方法，包括以下步骤：在适宜的条件下培养所述宿主细胞，收集培养液和/或所述宿主细胞的裂解液，然后进行分离纯化得到所述牛副流感病毒重组抗原。
[0016]在其中一个实施例中，所述分离纯化的方法包括离子交换层析、疏水层析、亲和层析和分子筛中的一种或多种。
[0017]本专利技术还提供了一种成套试剂盒，其包含上述牛副流感疫苗，以及用于接种所述牛副流感疫苗的容器。
[0018]本专利技术以筛选的F蛋白和HN蛋白局部片段为基础，而非全长蛋白，且在F蛋白片段和HN蛋白片段的C端均添加了牛抗体Fc片段，从而使两个蛋白片段在一个细胞内同时表达时能够形成更稳定的异二聚体，并显著增加了蛋白的免疫原性，优于同二聚体以及单体。通过实验证明，本专利技术的牛副流感病毒重组抗原能够在动物内产生较强的体液免疫，免疫后的动物能够抵御强毒攻毒，免疫效果较好，免疫期限较长。该牛副流感病毒重组抗原的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，且对动物没有致病性，能够安全高效地预防BPIV3，并可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。
附图说明
[0019]图1为实施例1中F基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.2kbp位置出现目的条带；
[0020]图2为实施例1中菌落PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.2kbp位置出现目的条带；
[0021]图3为实施例1中含有目的基因的真核表达载体pCI-F-GS的结构示意图；
[0022]图4为实施例2中HN基因PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp位置出现目的条带；
[0023]图5为实施例2中菌落PCR扩增产物的凝胶电泳图，其中在1.6kbp位置出现目的条带；
[0024]图6为实施例2中含有目的基因的真核表达载体pCI-F-HN-GS的结构示意图；
[0025]图7为实施例4中所获细胞培养物的非还原性SDS-PAGE检测图谱；
[0026]图8为实施例4中所获细胞培养物的还原性SDS-PAGE检测图谱；
[0027]图9为实施例5中非还原性SDS-PAGE电泳后产物的Western Blot检测图谱；
[0028]图10为实施例5中还原性SDS-PAGE电泳后产物的Western Blot检测图谱；
[0029]图11为实施例6的重组CHO(pCI-F-HN-GS)细胞表达产物免疫共沉淀检测结果图。
具体实施方式
[0030]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述，并给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0031]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种牛副流感病毒重组抗原，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的牛副流感病毒重组F蛋白和氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的牛副流感病毒重组HN蛋白，且所述牛副流感病毒重组F蛋白和所述牛副流感病毒重组HN蛋白形成异二聚体。2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有F基因和HN基因，所述F基因和所述HN基因分别编码权利要求1中的所述牛副流感病毒重组F蛋白和所述牛副流感病毒重组HN蛋白。3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述F基因和所述HN基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。4.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体基于pSV2-GS、pCI-GS或pcDNA4-GS构建得到。5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求2～4任一项所述的重组表达载体。6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞株。7.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹文龙，孔迪，滕小锘，张大鹤，
申请(专利权)人：苏州世诺生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：