RGD、TAT、GEL三基因重组减毒沙门菌LH430及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属重组减毒沙门菌领域，具体涉及一种RGD、TAT、GEL三基因重组减毒沙门菌LH430及其构建方法和应用。构建方法包括下述步骤：1)设计基因；2)PCR扩增；3)将获得的目的基因克隆到pMD

【技术实现步骤摘要】
RGD、TAT、GEL三基因重组减毒沙门菌LH430及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属重组减毒沙门菌领域，具体涉及一种RGD、TAT、GEL三基因重组减毒沙门菌LH430及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]乳腺肿瘤是患肿瘤疾病的雌性动物中患病率最高的，特别是小动物的重要临床疾病之一。诸如牛、羊、马、犬、猫等雌性个体中均有较高的概率罹患此病，其中犬最高，只有29％的未绝育的母犬不会发病。采用常规肿瘤治疗方法后，高风险乳腺癌病畜仍会死于肿瘤复发和转移。因此，寻找合适的载体和治疗药物将会极大改善乳腺癌对雌性动物的伤害。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种RGD、TAT、GEL三基因重组减毒沙门菌LH430及其构建方法和应用，将RGD、TAT和GEL基因克隆至真核表达载体pEGFP-N1的多克隆位点，转化入减毒伤寒沙门菌LH430中。构建双靶向调控GEL基因的重组减毒沙门菌LH430/pEGFP-RGD-TAT-GEL，拟通过双靶向表达治疗基因来实现诱导肿瘤细胞凋亡的试验目的。
[0004]本专利技术为实现上述目的，采用以下技术方案：
[0005]一种RGD、TAT、GEL三基因重组减毒沙门菌LH430的构建方法，包括下述步骤：
[0006]1)设计RGD-TAT-GEL基因SEQ ID NO.5；RGD-GEL基因SEQ ID NO.6；TAT-GEL基因SEQ ID NO.7；GEL基因SEQ ID NO.8；
[0007]2)RGD-TAT-GEL基因、RGD-GEL基因、TAT-GEL基因、GEL基因PCR扩增：以RGD-F SEQ ID NO.1和GEL-R SEQ ID NO.2为引物，扩增RGD-TAT-GEL基因和RGD-GEL基因；以TAT-F SEQ ID NO.3和GEL-R SEQ ID NO.2为引物，扩增TAT-GEL基因；以GEL-F SEQ ID NO.4和GEL-R SEQ ID NO.2为引物，扩增GEL基因；
[0008]3)将获得的目的基因克隆到pMD-18-T载体中，线性化重组穿梭载体后构建重组真核表达载体pEGFP-RGD-TAT-GEL，并用其转化感受态LH430，构建了包含上述目的基因的重组减毒沙门菌LH430。
[0009]本专利技术还包括一种根据所述的RGD、TAT、GEL三基因重组减毒沙门菌LH430的构建方法得到的RGD、TAT、GEL三基因重组减毒沙门菌LH430。
[0010]本专利技术还包括一种所述的RGD、TAT、GEL三基因重组减毒沙门菌LH430的应用，应用于防治人乳腺癌生物制品方面。
[0011]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
[0012]本专利技术将RGD对肿瘤细胞的靶向性、TAT对细胞的穿透性、GEL基因的细胞凋亡作用和减毒沙门菌LH430可携带外源基因靶向肿瘤微环境的厌氧区的特性结合起来，构建出能够融合表达上述基因的重组减毒沙门菌，使得RGD-TAT-GEL基因能够更好地发挥靶向性及
cancer)。这种恶性疾病在雄性动物身上发生概率不到1％，99％病发于雌性动物。现阶段分子生物学、基因学等相关学科已成为肿瘤治疗的热门，其中基因治疗尤为突出。此处使用的减毒菌株为鼠伤寒沙门菌(LH430，pho P/pho Q基因缺失)，该菌株毒力与亲本菌株相比大为降低，仍保留亲本菌株的侵袭力，是适宜的疫苗及载体候选菌株。肿瘤靶向肽RGD可有效识别肿瘤血管整合素αvβ3，由于乳腺癌细胞表面存在整合素αvβ3，RGD能够高度靶向乳腺癌细胞，进而抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭。TAT是一种11聚体的细胞穿膜肽(CPPs)，来源于人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)编码的转录反式激活蛋白，可有效地内化细胞，携带偶联药物进入细胞的小肽，且不引起细胞毒性反应。白树毒素(Gelonin，简称GEL)是一种Ⅰ型核糖体失活蛋白(RIPs)，可专一性水解真核细胞核糖体28S rRNA，从而抑制蛋白质生物合成导致细胞死亡。此处选择白树毒素基因作为人乳腺癌的治疗基因。同时，利用减毒沙门菌载体和RGD的双靶向调控作用在降低对正常组织伤害作用的同时保持GEL基因治疗效果，充分发挥抑癌作用。
[0028]本专利技术将RGD、TAT和GEL基因导入减毒沙门菌LH430，包括以下步骤：
[0029]1)RGD-TAT-GEL基因片段、RGD-GEL基因片段、TAT-GEL基因片段和GEL基因片段的扩增与克隆；
[0030]2)靶向表达RGD-TAT-GEL基因的真核表达载体的构建；
[0031]3)携带重组真核表达载体的减毒沙门菌菌株的构建与鉴定；
[0032]4)重组减毒沙门菌LH430诱导人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的体外抑制效果。
[0033]具体包括步骤如下：
[0034]1)根据GenBank中RGD基因序列(1FUL_A)、TAT基因(ADK70247.1)第47-57氨基酸序列和Gelonin基因序列(AAB47013.1)设计RGD-TAT-GEL基因SEQ ID NO.5；根据RGD基因序列(1FUL_A)和Gelonin基因序列(AAB47013.1)设计RGD-GEL基因SEQ ID NO.6；根据TAT基因(ADK70247.1)第47-57氨基酸序列和Gelonin基因序列(AAB47013.1)设计TAT-GEL基因SEQ ID NO.7；根据Gelonin基因序列(AAB47013.1)设计GEL基因SEQ ID NO.8；
[0035]2)RGD-TAT-GEL基因、RGD-GEL基因、TAT-GEL基因、GEL基因PCR扩增：以RGD-F SEQ ID NO.1和GEL-R SEQ ID NO.2为引物，扩增RGD-TAT-GEL基因和RGD-GEL基因；以TAT-F SEQ ID NO.3和GEL-R SEQ ID NO.2为引物，扩增TAT-GEL基因；以GEL-F SEQ ID NO.4和GEL-R SEQ ID NO.2为引物，扩增GEL基因；
[0036]3)将获得的目的基因克隆到pMD-18-T载体中，线性化重组穿梭载体后构建重组真核表达载体pEGFP-RGD-TAT-GEL，并用其转化感受态LH430，构建了包含上述目的基因的重组减毒沙门菌LH430。
[0037]上述重组减毒沙门菌LH430的制备方法获得的重组减毒沙门菌LH430在制备防治人乳腺癌生物制品方面的应用。
[0038]也就是说，根据白树毒素基因序列得到的GEL基因序列；根据肿瘤靶向肽蛋白序列和白树毒素基因序列得到的RGD-GEL基因序列；根据细胞穿膜肽蛋白序列和白树毒素基因序列得到的TAT-GEL基因序列；根据肿瘤靶向肽蛋白序列、细胞穿膜肽蛋白序列和白树毒素基因序列得到的RGD-TAT-GEL基因序列。将获得的目的基因克隆到pMD-18-T载体中，线性化重组穿梭载体后构建重组真核表达载体pEGFP-本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种RGD、TAT、GEL三基因重组减毒沙门菌LH430的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：1)设计RGD-TAT-GEL基因SEQ ID NO.5；RGD-GEL基因SEQ ID NO.6；TAT-GEL基因SEQ ID NO.7；GEL基因SEQ ID NO.8；2)RGD-TAT-GEL基因、RGD-GEL基因、TAT-GEL基因、GEL基因PCR扩增：以RGD-F SEQ ID NO.1和GEL-R SEQ ID NO.2为引物，扩增RGD-TAT-GEL基因和RGD-GEL基因；以TAT-F SEQ ID NO.3和GEL-R SEQ ID NO.2为引物，扩增TAT-GEL...

【专利技术属性】
技术研发人员：金天明，蓝肇煜，李丹，王小月，武静桥，范真玮，姚景丽，赵微，陈婷，何敬文，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：