原位基因测序方法技术

本发明专利技术提供用于对完整组织内细胞中的靶核酸进行原位基因测序的设备、方法和系统。本发明专利技术还提供筛选候选试剂以确定所述候选试剂能否调控完整组织内细胞中核酸的基因表达的方法。方法。方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】原位基因测序方法
交叉引用
[0001]本专利申请案主张于2018年4月9日提交的编号为62/655,052的美国临时专利申请案、于2018年6月20日提交的编号为62/687,490的美国临时专利申请案以及于2019年2月20日提交的编号为62/808,159的美国临时专利申请案的优先权；上述专利中的内容以引用方式全文并入本文中。介绍
[0002]在生物组织中，功能的多样性源自于形态的多样性，部分源自于细胞特异性基因表达的复杂性，这决定了各组织的独特三维分子解剖结构和细胞特性。现已出现用于测绘具有亚细胞分辨率的基因表达空间图谱的原位转录组分析工具，这种工具可能适用于探究这些组织结构-功能关系，包括多重原位RNA杂交和原位RNA测序。现有的原位测序方法在致密、复杂的组织环境中面临着实现酶促反应的挑战，且目前的测序效率低下，但是这种组织内测序法有着巨大的潜在价值；与基于杂交的多重分析/读数(其利用多个多核苷酸探针对基因同一性、测序进行编码)相比，这种组织内测序法可以在单核苷酸分辨率下进行操作，因此本质上其提供的信息量大幅增加。但是，由于实现在组织(例如，哺乳动物大脑)中的通量所必需的灵敏度、保真度和可扩展性方面的基础性限制，现有的测序方法不适用于3D完整组织。例如，哺乳动物大脑由各种复杂的细胞类型组成，其多样性对于取决于差异基因表达和电路特异性解剖结构的功能至关重要。在细胞分辨率下保留3D定位解剖结构的同时，获取高内涵基因表达信息较为困难，这限制了对大脑结构和功能的全面了解。本专利技术解决了上述问题并提供了相应的优势。
专利技术内容
[0003]本专利技术提供用于对完整组织内细胞中的靶核酸进行原位基因测序的设备、方法和系统。本专利技术还提供筛选候选试剂以确定所述候选试剂能否调控完整组织内细胞中核酸的基因表达的方法。
[0004]本专利技术提供一种用于对完整组织内细胞中的靶核酸进行原位基因测序的方法，所述方法包含：(a)在允许发生特异性杂交的条件下，使固定透化完整组织与至少一对寡核苷酸引物接触，其中所述引物对包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸；其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自包含第一互补性区域、第二互补性区域和第三互补性区域；其中所述第二寡核苷酸进一步包含条形码序列；其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域与所述靶核酸的第一部分互补，其中所述第一寡核苷酸的第二互补性区域与所述第二寡核苷酸的第一互补性区域互补，其中所述第一寡核苷酸的第三互补性区域与所述第二寡核苷酸的第三互补性区域互补，其中所述第二寡核苷酸的第二互补性区域与所述靶核酸的第二部分互补，而且其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域与所述第二寡核苷酸的第二互补性区域相邻；(b)加入连接酶以连接所述第二寡核苷酸，并生成封闭的核酸环；(c)在核酸分子存在的情况下进行滚环扩增，其中所述操作包含采用所述第二寡核苷酸作为模板，以及采用所述第一寡核苷酸作为促使聚合酶形成一个或更多个扩增子的引物；(d)在水凝胶亚单元
存在的情况下包埋所述一个或更多个扩增子，以形成一个或更多个水凝胶包埋的扩增子；(e)在允许连接的条件下，使具有条形码序列的所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子与一对引物接触，其中所述引物对包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，其中仅在第三寡核苷酸和第四寡核苷酸与同一扩增子连接时，方实现连接；(f)重复步骤(e)；以及(g)对所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子进行成像，以确定完整组织内细胞中靶核酸的原位基因测序。在一些情况下，所述引物对在接触所述样品之前加热变性。在一些情况下，所述细胞存在于细胞群中。在一些情况下，所述细胞群包括多种细胞类型。
[0005]本专利技术还提供一种筛选候选试剂以确定所述候选试剂能否调控完整组织内细胞中核酸的基因表达的方法，所述方法包含：(a)在允许发生特异性杂交的条件下，使固定透化完整组织与至少一对寡核苷酸引物接触，其中所述引物对包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸；其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自包含第一互补性区域、第二互补性区域和第三互补性区域；其中所述第二寡核苷酸进一步包含条形码序列；其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域与所述靶核酸的第一部分互补，其中所述第一寡核苷酸的第二互补性区域与所述第二寡核苷酸的第一互补性区域互补，其中所述第一寡核苷酸的第三互补性区域与所述第二寡核苷酸的第三互补性区域互补，其中所述第二寡核苷酸的第二互补性区域与所述靶核酸的第二部分互补，而且其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域与所述第二寡核苷酸的第二互补性区域相邻；(b)加入连接酶以连接所述第二寡核苷酸，并生成封闭的核酸环；(c)在核酸分子存在的情况下进行滚环扩增，其中所述操作包含采用所述第二寡核苷酸作为模板，以及采用所述第一寡核苷酸作为促使聚合酶形成一个或更多个扩增子的引物；(d)在水凝胶亚单元存在的情况下包埋所述一个或更多个扩增子，以形成一个或更多个水凝胶包埋的扩增子；(e)在允许连接的条件下，使具有条形码序列的所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子与一对引物接触，其中所述引物对包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，其中仅在第三寡核苷酸和第四寡核苷酸与同一扩增子连接时，方实现连接；(f)重复步骤(e)；(g)对所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子进行成像，以确定完整组织内细胞中靶核酸的原位基因测序；以及(h)检测所述靶核酸的基因表达水平，其中在所述至少一种候选试剂存在的情况下所述靶核酸的表达水平相对于在所述至少一种候选试剂不存在的情况下所述靶核酸的表达水平所发生的变化表明，所述至少一种候选试剂调控完整组织内细胞中核酸的基因表达。在一些情况下，所述引物对在接触所述样品之前加热变性。在一些情况下，所述细胞存在于细胞群中。在一些情况下，所述细胞群包括多种细胞类型。
[0006]本专利技术还提供按照本文所述的方法使用的设备。在一些实施例中，提供了用于自动实施本文所述的方法的流体系统，从而允许连续操作。在一些实施例中，所述系统包括流体设备、被配置成实施本文所述的方法的处理器。
附图说明
[0007]图1A-1E描述了本文所述的空间分辨转录物扩增子读数图测绘(STARmap)方法的示意图，该方法包括在3D组织环境内对空间转录组学进行原位RNA测序。
[0008]图2A-2I描述了用于实现高质量RNA成像和小鼠大脑实例化的基于分子内连接的核酸特异性扩增(SNAIL)探针。
[0009]图3A-3H描述了在STARmap中用于减少背景噪点和固定扩增子的水凝胶组织化学
方法(HTC)。
[0010]图4A-4L描述了动态退火和连接法测序(SEDAL)方面，其中SEDAL是STARmap的低背景噪点纠错原位测序组成部分。
[0011]图5A-5N描述了采用本文所述的方法对初级视皮层中的细胞类型进行分类的情况。
[0012]图6A-6C描述了用于STARmap的数据处理流水线。
[0013]图7A-7D描述了适用于抑制性和兴奋性亚聚类STAR图谱测绘的基因表达信息。
[0014]图8A-8C描述了非神经元细胞类型的亚聚类。
[0015本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于对完整组织内细胞中的靶核酸进行原位基因测序的方法，所述方法包含：(a)在允许发生特异性杂交的条件下，使固定透化完整组织与至少一对寡核苷酸引物接触，其中所述引物对包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸；其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自包含第一互补性区域、第二互补性区域和第三互补性区域；其中所述第二寡核苷酸进一步包含条形码序列；其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域与所述靶核酸的第一部分互补，其中所述第一寡核苷酸的第二互补性区域与所述第二寡核苷酸的第一互补性区域互补，其中所述第一寡核苷酸的第三互补性区域与所述第二寡核苷酸的第三互补性区域互补，其中所述第二寡核苷酸的第二互补性区域与所述靶核酸的第二部分互补，而且其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域与所述第二寡核苷酸的第二互补性区域相邻；(b)加入连接酶以连接所述第二寡核苷酸，并生成封闭的核酸环；(c)在核酸分子存在的情况下进行滚环扩增，其中所述操作包含采用所述第二寡核苷酸作为模板，以及采用所述第一寡核苷酸作为促使聚合酶形成一个或更多个扩增子的引物；(d)在水凝胶亚单元存在的情况下包埋所述一个或更多个扩增子，以形成一个或更多个水凝胶包埋的扩增子；(e)在允许连接的条件下，使具有条形码序列的所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子与一对引物接触，其中所述引物对包含第三寡核苷酸和第四寡核苷酸，其中仅在第三寡核苷酸和第四寡核苷酸与同一扩增子连接时，方实现连接；(f)重复步骤(e)；以及(g)对所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子进行成像，以确定完整组织内细胞中靶核酸的原位基因测序。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物对在接触所述样品之前加热变性。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述细胞存在于细胞群中。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细胞群包含多种细胞类型。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中接触所述固定透化完整组织包含使所述引物对与同一靶核酸杂交。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是RNA。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述RNA是mRNA。8.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是DNA。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸包含挂锁探针。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域的长度为19-25个核甘酸。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的第二互补性区域的长度为6个核甘酸。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的第三互补性区域的长度为6个核甘酸。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸的第一互补性区
域的长度为6个核甘酸。14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸的第二互补性区域的长度为19-25个核甘酸。15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸的第三互补性区域的长度为6个核甘酸。16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸的第一互补性区域包含所述第二寡核苷酸的5'末端。17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸的第三互补性区域包含所述第二寡核苷酸的3'末端。18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸的第一互补性区域与所述第二寡核苷酸的第三互补性区域相邻。19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸的条形码序列提供用于识别所述靶核酸的条形码信息。20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中接触所述固定透化完整组织包含使对不同靶核酸具有特异性的多种寡核苷酸引物杂交。21.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二寡核苷酸以封闭的核酸环形式提供，且省略加入连接酶的步骤。22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中选定寡核苷酸的所述解链温度(T
m
)以最大限度地减少寡核苷酸在溶液中的连接。23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中加入连接酶包含加入DNA连接酶。24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述核酸分子包含经胺修饰的核苷酸。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述经胺修饰的核苷酸包含丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺部分修饰。26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述包埋包含使所述一个或更多个扩增子与丙烯酰胺共聚合。27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述包埋包含使所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子透明化，其中所述靶核酸基本上留存于所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子中。28.根据权利要求27所述的方法，其中所述透明化包含基本上去除所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子中的多种细胞组分。29.根据权利要求27或28所述的方法，其中所述透明化包含基本上去除所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子中的脂质。30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述第三寡核苷酸被配置成解码碱基。31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述第四寡核苷酸被配置成将已解码碱基转换成信号。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述信号为荧光信号。33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中接触所述一个或更多个水凝胶包埋
的扩增子包含消除测序过程中的错误积累。34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述成像包含利用共聚焦显微技术、双光子显微技术、光场显微技术、完整组织膨胀显微技术和/或经CLARITY
TM
优化的单层光显微技术(COLM)对所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子进行成像。35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述完整组织为薄切片。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述完整组织的厚度为5-20μm。37.根据权利要求35或36所述的方法，其中接触所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子发生四次或更多次。38.根据权利要求35或36所述的方法，其中接触所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子发生五次或更多次。39.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述完整组织为厚切片。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述完整组织的厚度为50-200μm。41.根据权利要求39或40所述的方法，其中接触所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子发生六次或更多次。42.根据权利要求39或40所述的方法，其中接触所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子发生七次或更多次。43.一种筛选候选试剂以确定所述候选试剂能否调控完整组织内细胞中核酸的基因表达的方法，所述方法包含：(a)在允许发生特异性杂交的条件下，使固定透化完整组织与至少一对寡核苷酸引物接触，其中所述引物对包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸；其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自包含第一互补性区域、第二互补性区域和第三互补性区域；其中所述第二寡核苷酸进一步包含条形码序列；其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域与所述靶核酸的第一部分互补，其中所述第一寡核苷酸的第二互补性区域与所述第二寡核苷酸的第一互补性区域互补，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：王潇，W，
申请(专利权)人：小利兰，
类型：发明
国别省市：