一种用于血性体液样本肿瘤细胞的离心分层富集法制造技术

本发明专利技术涉及一种用于血性体液样本肿瘤细胞的离心分层富集法，具体包括如下步骤：收集有肺腺癌原发灶且出现胸水转移的病例，留取未经固定的新鲜血性体液样本；去除样本中肉眼可见的蛋白和血凝块后对样本进行摇匀并离心，观察上清液与沉淀物的分层情况；对有出现分层的样本观察沉淀物大小及移动情况；出现分层时，当沉淀物小于2mL，取全部管底沉淀物，当沉淀物大于2mL且固定在管底不移动时，取沉血表面物；出现分层时，取会移动的沉淀物与破红液按照1:1～4的体积比进行混匀破红后取破红析出物；不出现分层时，选取无法分层的样本与与破红液按照1:1～4的体积比进行混匀破红后取破红析出物。物。

【技术实现步骤摘要】
一种用于血性体液样本肿瘤细胞的离心分层富集法


[0001]本专利技术涉及一种用于血性体液样本肿瘤细胞的离心分层富集法，属于医学病理学细胞病理分析


技术介绍

[0002]人体几乎所有系统的恶心肿瘤都可能发生浆膜腔播散，以肺癌、胃肠癌、乳腺癌、卵巢癌等多见，其中肺腺癌的转移最常见，多由肿瘤细胞破坏或瘤栓阻塞淋巴管、血管引起，因此常形成血性浆膜腔积液，通过浆膜腔积液细胞学检测往往可进行早期诊断。胸腺癌转移至胸腺或心包所产生的血性胸腔积液或心包积液肉眼可呈现深浅不一的红色，对于深红色的浓血性胸水常常因为取材时红细胞过多、而有效肿瘤细胞较少；红细胞和肿瘤细胞及蛋白粘液等成分混合，干扰了肿瘤细胞的分离等原因对后续的免疫细胞化学染色和分子检测造成困扰，从而发生漏诊或假阴性，因此，进行浆膜腔积液细胞学检测时如何破坏红细胞，使得样本分层富集肿瘤细胞，使得肿瘤细胞更为集中，并保持完整的细胞形态和良好的抗原性，是提高此类样本的细胞病理检出率的关键所在。
[0003]目前，浆膜腔积液细胞学检测中有采用％乙酸乙醇来处理血性积液，乙酸对肿瘤细胞的膨胀和乙醇对肿瘤细胞的收缩可以相互抵消，对于离心分层后沉淀物会移动的血性胸水中呈现红细胞溶解背景干净，但是，在这一过程中无法分层的血性胸水中乙酸溶解红细胞的碎片会加深染色的背景，而且在实验中发现，转移性肺腺癌的血性胸水中，单独使用乙酸或是混合液作为破红处理剂的病例， TTF-1抗体细胞核标记无或少表达，可能是乙酸快速的沉淀核蛋白使得TTF-1蛋白丢失。现有技术中还有用新柏氏细胞清洗液溶解红细胞，此类清洗液主要是醇类的成分，对于离心分层后沉淀物会移动的血性胸水去除红细胞，富集肿瘤细胞的效果良好，但醇类会沉淀无法分层的血性胸水中肉眼看不见的蛋白等，使得肿瘤细胞分散，细胞轻度收缩。因此，在浆膜腔积液细胞学检测中亟需一种能够溶解红细胞以避免红细胞对肿瘤细胞的干扰和掩盖，同时能够保存血性体液中肿瘤细胞形态的完整和良好抗原性的方法。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术所存在的上述问题，本专利技术提供了一种用于血性体液样本肿瘤细胞的离心分层富集法，能够同时完成红细胞溶解和有核细胞集中保护两个过程，避免红细胞对有核细胞分离的干扰。
[0005]本专利技术的技术方案如下：
[0006]一种用于血性体液样本肿瘤细胞的离心分层富集法，具体包括如下步骤：
[0007](1)收集有肺腺癌原发灶且出现胸水转移的病例，留取未经固定的新鲜血性体液样本；
[0008](2)立即去除样本中肉眼可见的蛋白和血凝块后对样本进行摇匀并离心，观察上清液与沉淀物的分层情况；
[0009](3)对有出现分层的样本观察沉淀物大小及移动情况；出现分层时，当沉淀物小于2mL，取全部管底沉淀物，当沉淀物大于2mL且固定在管底不移动时，取沉血表面物；
[0010](4)经过步骤(3)分层沉淀处理后，出现分层时，取会移动的沉淀物与破红液按照1:1～4的体积比进行混匀破红后取破红析出物；不出现分层时，选取无法分层的样本与与破红液按照1:1～4的体积比进行混匀破红后取破红析出物；
[0011](5)取经过步骤(3)获得的管底沉淀物、沉血表面物以及经过步骤(4) 获得的破红析出物分别制成细胞蜡块；
[0012](6)经过步骤(5)制得的细胞蜡块切片，行苏木素伊红染色及免疫细胞化学染色及分子病理检测。
[0013]进一步地，所述步骤(4)中破红液为体积分数为10％的中性缓冲福尔马林溶液与50％的乙醇溶液按照体积比为1:1的混合液。
[0014]进一步地，所述步骤(5)中制备细胞蜡块具体包括以下步骤：
[0015]A1、在管底沉淀物、沉血表面物和破红析出物中加入固定液，吹打混匀后静置5～10min，再离心分离，去上清液留取沉淀物；
[0016]A2、在经过步骤A1取得的沉淀物中加入过渡凝集液，吹打混匀后静置 5～10min，再离心分离，去上清液留取沉淀物；
[0017]A3、沿着装有沉淀物的离心管的侧壁缓慢的加入有伊红标记的成块凝集液进行沉淀物凝集并静置2～3h；
[0018]A4、取经过步骤A3成块凝集于离心管管底的凝集沉淀物，并用棉纸包被，脱水机脱水后浸蜡包埋制成细胞蜡块。
[0019]进一步地，所述步骤A1中固定液为体积分数为10％的中性缓冲福尔马林溶液，固定液的加入量30-50ml。
[0020]进一步地，所述步骤A2中过渡凝集液为体积分数为75％的乙醇溶液，过渡凝集液的加入量30-50ml。
[0021]进一步地，所述步骤A3中成块凝集液为体积分数为95％的乙醇溶液，过渡凝集液的加入量30-50ml。
[0022]本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供一种用于血性体液样本肿瘤细胞的离心分层富集法，能够克服现有技术中由于血性体液中红细胞和有核细胞及蛋白粘液等成分混合造成对对有核细胞的干扰和掩盖，同时通过离心分离后肉眼观察呈现分层与否以及沉淀物的大小能够对血性体液样本进行差异性取材收集有核细胞，减少耗材，节约时间；采用体积分数为50％的乙醇溶液和10％的中性缓冲福尔马林溶液进行破红，主要是应用50％乙醇溶液裂解红细胞和10％中性缓冲福尔马林溶液固定有核细胞，呈现红色的上清液和灰白色的沉淀物，灰白色的沉淀物中残留少量的红细胞，再通过固定液10％中性缓冲福尔马林溶液巩固固定肿瘤细胞，以及75％和95％梯度乙醇溶液重复凝集，使得破红析出物镜下背景干净，有核细胞尤其是肿瘤细胞集中，免疫细胞化学染色抗体表达良好。
具体实施方式
[0023]下面结合较佳实施例对本专利技术做进一步的说明。
[0024]实施例1
[0025]一种用于血性体液样本肿瘤细胞的离心分层富集法，具体包括如下步骤：
[0026]收集有肺腺癌原发灶且出现胸水转移的病例，留取未经固定的新鲜血性体液样本；
[0027](1)立即去除每一份样本中肉眼可见的蛋白和血凝块后对样本进行摇匀，取2管各50mL的样本于离心管中，离心分离5min，观察上清液与沉淀物的分层情况；
[0028](2)对有出现分层的样本观察沉淀物大小及移动情况；出现分层时，当沉淀物小于2mL，取全部管底沉淀物，当沉淀物大于2mL且固定在管底不移动时，取沉血表面物；
[0029](3)经过步骤(3)分层沉淀处理后，出现分层时，取会移动的沉淀物与破红液按照1:1的体积比进行混匀破红后取破红析出物；不出现分层时，选取无法分层的样本与破红液按照1:4的体积比进行混匀破红后取破红析出物；会分层的沉淀物与无法分层的样本取10mL，破红液取40mL于2500r/min的振荡器中混匀；所述破红液为体积分数为10％的中性缓冲福尔马林溶液与50％的乙醇溶液按照体积比为1:1的混合液；
[0030](4)取经过步骤(3)获得的管底沉淀物、沉血表面物以及经过步骤(4) 获得的破红析出物分别制成细胞蜡块；
[0031](5)经过步骤(5)制得的细胞蜡块切片，行苏木素本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于血性体液样本肿瘤细胞的离心分层富集法，其特征在于，具体包括如下步骤：(1)收集有肺腺癌原发灶且出现胸水转移的病例，留取未经固定的新鲜血性体液样本；(2)立即去除样本中肉眼可见的蛋白和血凝块后对样本进行摇匀并离心，观察上清液与沉淀物的分层情况；(3)对有出现分层的样本观察沉淀物大小及移动情况；出现分层时，当沉淀物小于2mL，取全部管底沉淀物，当沉淀物大于2mL且固定在管底不移动时，取沉血表面物；(4)经过步骤(3)分层沉淀处理后，出现分层时，取会移动的沉淀物与破红液按照1:1～4的体积比进行混匀破红后取破红析出物；不出现分层时，选取无法分层的样本与与破红液按照1:1～4的体积比进行混匀破红后取破红析出物；(5)取经过步骤(3)获得的管底沉淀物、沉血表面物以及经过步骤(4)获得的破红析出物分别制成细胞蜡块；(6)经过步骤(5)制得的细胞蜡块切片，行苏木素伊红染色及I免疫细胞化学染色及分子病理检测。2.如权利要求1所述的一种用于血性体液样本肿瘤细胞的离心分层富集法，其特征在于：所述步骤(4)中破红液为体积分数为10％的中性缓冲福尔马林溶液与50％的乙醇溶液按照体积比为1:1～2的混合液。3.如权利要求1所述的一种用于血性...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾赛凡，张声，王行富，王雪丹，陈余朋，陈祥娜，任彩虹，李国平，吴平，
申请(专利权)人：福建医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：