一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法技术

本发明专利技术涉及高效液相色谱检测技术领域，公开了一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，包括：1）称取5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸样品并将其添加至硫酸水溶液中，超声震荡，使样品溶解至无色透明，得到样品溶液；2）取样品溶液用流动相稀释定容，超声处理；所述流动相为0.18-0.22wt%的戊烷磺酸钠溶液和乙腈的混合溶液；3)对步骤3）所得溶液自动进样，进行高效液相色谱检测，获得结果。本发明专利技术采用高效液相色谱法对产品进行定量检测，具有灵敏度高、快速分离、准确定量，分离度良好、检测时间短等优点，克服了滴定分析不准确的缺点，所得到的峰形好，样品线性好。样品线性好。样品线性好。

【技术实现步骤摘要】
一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法


[0001]本专利技术涉及高效液相色谱检测
，尤其涉及一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3
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羧酸的高效液相色谱检测方法。

技术介绍

[0002]5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸是合成抗病毒药物利巴韦林的一个重要的中间体。目前国内对其含量的主要分析方法有以下几种：(1)针对其氨基采用高氯酸滴定法。其步骤和原理为：步骤：精确称取5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸0.1g，加冰乙酸30mL，加热回流至溶解，冷却到室温。加α-萘酚苯甲醇指示剂2滴，用0.1mol/L高氯酸滴定至显绿色即为终点。同时做空白校对。(每1mL高氯酸相当于12.8mg环合物)。
[0003]原理：产品中含有氨基和羧基，溶解在冰乙酸中时显示碱性较多，可以用高氯酸滴定检测含量。
[0004](2)针对其羧基采用的盐酸的滴定法。其步骤和原理为：步骤：称取样品置于烧杯中，用移液管移取氢氧化钠标准溶液，加热使之完全溶解，静置 45min，加入酚酞指示剂，用0.1mol/L的盐酸溶液滴定至红色褪去，记录数据，同时做空白试验，同时记录消耗盐酸的体积。
[0005]原理：产品中含有羧基，利用酸碱中和的原理。
[0006]总体来说，由于5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸难以溶于大部分的溶剂，所以现有技术中都采用了滴定的方法。但由于滴定试剂准确度和5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸中影响滴定的杂质基团的影响，造成含量或多或少存在偏差影响后续产品的质量控制。因此有必要开发出一种精准性更好的新检测方法。

技术实现思路

[0007]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，本专利技术采用高效液相色谱法对产品进行定量检测，具有灵敏度高、快速分离、准确定量，分离度良好、检测时间短等优点，克服了滴定分析不准确的缺点，所得到的峰形好，样品线性好。
[0008]本专利技术的具体技术方案为：一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：1)称取5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸样品并将其添加至硫酸水溶液中，超声震荡，使样品溶解至无色透明，得到样品溶液。
[0009]2)取样品溶液用流动相稀释定容，超声处理；所述流动相为0.18-0.22wt％的戊烷磺酸钠溶液和乙腈的混合溶液。
[0010]3)对步骤3)所得溶液自动进样，进行高效液相色谱检测，获得结果。
[0011]本专利技术首先对样品进行衍生化，然后再进行高效液相色谱，在特定的检测条件下，本专利技术方法的可重复性好，保证了产品的准确定性定量。
[0012]本专利技术衍生化的原理为利用硫酸将产品制成硫酸盐，使其易溶于以水相为主的流动相中，其他含有氨基的杂质也可以生成硫酸盐，在色谱柱内进行分离。
[0013]本专利技术选个限定流动相组成，本专利技术选择戊烷磺酸钠溶液和乙腈作为流动相的原因在于：根据本专利技术团队的大量实践结果，使用戊烷磺酸钠溶液和乙腈体系做为流动相，可以使样品的保留时间比较好，产品出峰时间不会太晚，也不会太早，并且和杂质具有较好的分离度。
[0014]作为优选，步骤1)中，所述硫酸水溶液的浓度为0.08-0.12N，所述样品与硫酸水溶液的用量比为23-27mg/10mL。
[0015]本专利技术选择硫酸水溶液并严格限定上述参数，其原因在于，本专利技术团队在实践中发现，若使用其他酸的水溶液难以使样品的衍生化，且在流动相中的溶解度不好，容易造成色谱柱堵塞。限定硫酸浓度是为了使样品的pH值满足色谱柱的pH值要求。PH值太低容易损坏色谱柱，太高使得产品出峰拖尾，含量检测不准确。
[0016]作为优选，步骤1)中，超声震荡时间为3-7min。
[0017]作为优选，步骤2)中，将样品溶液用流动相稀释定容至原体积4-6倍。
[0018]作为优选，步骤2)中，超声时间为30sec-3min。
[0019]作为优选，步骤2)中，所述戊烷磺酸钠溶液的制备方法为：取戊烷磺酸钠，加水溶解后用磷酸溶液调节pH值至1.8-2.2。
[0020]若pH值太低容易损坏色谱柱，若pH太高则使得产品出峰拖尾，含量检测不准确。
[0021]作为优选，步骤2)中，所述戊烷磺酸钠溶液与乙腈的体积比为(96-98)∶(2-4)。
[0022]本专利技术限定上述参数范围的原因是，本专利技术团队发现若体积比过高，流动相极性太大，出峰过早，容易受基线波动干扰，造成检测不准确。若过低，流动相极性较弱，出峰时间太长，浪费时间。
[0023]作为优选，步骤3)中，自动进样量为5-20μL。
[0024]作为优选，步骤3)中，高效液相色谱检测所采用的仪器型号为Waters 2695；GC柱子规格为ODS-C18，5um，4.6*250mm；检测器型号为PDA996。
[0025]作为优选，步骤3)中，检测波长为204nm；流速为0.8-1.2mL/min；柱温30-35℃；运行时间为13-17min。
[0026]虽然本专利技术进行了衍生化以及采用HPLC，但是若要实现更高的精准性、灵敏性，同时需要严格控制HPLC的检测条件。
[0027]本专利技术将流速控制在0.8-1.2ml/min，过高会导致出峰较早，杂质和产品的分离度下降。过低会导致产品出峰拖尾，峰宽变大，出峰时间太长。本专利技术将柱温控制在30-35℃，过高，容易造成流动相在色谱柱内产生气泡，影响出峰稳定性。过低，会导致产品在流动相中析出，长时间会导致色谱柱堵塞。
[0028]与现有技术对比，本专利技术的有益效果是：本专利技术采用高效液相色谱法对产品进行定量检测，具有灵敏度高、快速分离、准确定量，分离度良好、检测时间短等优点，克服了滴定分析不准确的缺点，所得到的峰形好，样品线性好。
附图说明
[0029]图1为实施例1检测所得谱图；图2为实施例2中不同进样量所得谱图峰型；图3为实施例2中进样量与峰面积对应图；图4为实施例3检测所得谱图。
具体实施方式
[0030]下面结合实施例对本专利技术作进一步的描述。
[0031]总实施例具体检测方法：仪器：Waters 2695GC柱子规格：C18 5um，4.6*250mm检测器：PDA996流动相：以0.18-0.22戊烷磺酸钠溶液(取戊烷磺酸钠，加水1000mL溶解后用磷酸溶液调节pH值至1.8-2.2)-乙腈(96-98∶2-4)为流动相；检测波长：204nm；流速：0.8-1.2mL/min柱温：30-35℃制样：精密称定23-25mg样品加入10mL的0.08-0.12N的硫酸水溶液中，超声震荡3-7mins，样品溶解至无色透明，取2mL样品溶液用流动相定容至10mL，超声30sec-3min，进样5-20μL，运行13-17mins。
[0032]实施例1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于包括以下步骤：1）称取5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸样品并将其添加至硫酸水溶液中，超声震荡，使样品溶解至无色透明，得到样品溶液；2）取样品溶液用流动相稀释定容，超声处理；所述流动相为0.18-0.22wt%的戊烷磺酸钠溶液和乙腈的混合溶液；3)对步骤3）所得溶液自动进样，进行高效液相色谱检测，获得结果。2.如权利要求1所述的一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤1）中，所述硫酸水溶液的浓度为0.08-0.12N，所述样品与硫酸水溶液的用量比为23-27mg/10mL。3.如权利要求1或2所述的一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤1）中，超声震荡时间为3-7min。4.如权利要求1所述的一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤2）中，将样品溶液用流动相稀释定容至原体积4-6倍。5.如权利要求1或4所述的一种5-氨基-1H-1，2，4-三氮唑-3-羧酸的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤2）中，超声时间为30sec-...

【专利技术属性】
技术研发人员：林峰，
申请(专利权)人：杭州盛弗泰新材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：