一个水稻粒长基因的基因工程应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程领域，公开了一个参与调控水稻粒长的基因OsAK3的克隆以及在调控水稻粒长方面的应用。该基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1，过量表达水稻基因OsAK3可以增加水稻粒长，利于水稻粒型的遗传改良。OsAK3功能缺失突变体籽粒粒长变短，株高变矮，分蘖数减少；本发明专利技术OsAK3基因可用于水稻产量性状的遗传改良。明OsAK3基因可用于水稻产量性状的遗传改良。明OsAK3基因可用于水稻产量性状的遗传改良。

【技术实现步骤摘要】
一个水稻粒长基因的基因工程应用


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，涉及一种控制水稻粒长基因OsAK3的克隆与应用。

技术介绍

[0002]水稻是世界上最重要的农作物之一。提高水稻产量是全球人口快速增长的迫切需求。粒型是决定水稻产量的主要因素之一，因此粒型一直是水稻育种的重要目标。水稻粒型性状主要包括粒长、粒宽、粒厚、长宽比，属于数量性状，受胚、胚乳及母体植株等不同遗传体系的控制。水稻粒型还影响到稻米的外观品质和商品价值。在中国南方、美国和大多数亚洲国家，人们更习惯长或细长型稻米，而韩国、日本、中国北方则习惯短圆型稻米(Harberd N P,2015)。此外，粒型也是进化中一个易于被选择的表型，是研究水稻进化的一个重要性状(Meyer R S,2013)。因此，克隆粒型相关的基因并深入研究和阐明粒型形成的基因调控网络，可为水稻高产、优质分子育种提供重要的理论基础和基因资源。
[0003]目前的研究表明，水稻粒型受多个遗传体系所控制，已知的有G蛋白信号通路、泛素—蛋白酶体通路、MAPK信号通路、表观修饰及植物激素信号通路等多个水稻粒型调控通路。GS3是第一个被鉴定出来的水稻粒型QTL。利用明恢63(大粒)和川7(小粒)杂交获得的近等基因系，通过图位克隆的方法定位到了GS3。该基因编码一个G蛋白γ亚基，GS3功能的缺失促进细胞伸长，进而产生长粒(Fan et al,2006)。而水稻G蛋白α亚基D1功能缺失突变体d-1表现矮秆小粒表型，对BR的敏感性降低，表明D1介导的异源三聚体G蛋白与BR信号转导途径共同调控水稻粒型(Miura K et al,2009)。G蛋白β亚基(RGB1)表达量的降低也会导致水稻出现籽粒变小的表型(Mao H et al,2010)。GW2是控制粒宽的一个主效QTL，该基因编码一个含有RING环的E3泛素连接酶，功能缺失突变体小穗外壳细胞增殖增强，加速了籽粒灌浆，从而提高了粒宽、粒重和产量(Song et al,2007)。脱泛素酶OsOTUB1/WTG1的功能缺失会使粒宽增加，籽粒变厚，每穗粒数也增多(Huang et al,2017)。OsOTUB1主要通过影响细胞扩增来调控粒型。OsOTUB1和理想株型的重要调控因子OsSPL14/IPA1互作，这种互作限制了OsSPL14的K63连接泛素化，从而促进了K48连接泛素化依赖性蛋白酶体降解(Wang et al,2017)。MAPK级联是真核生物中进化保守的信号模块，在植物发育和防御信号转导中起着关键作用(Meng 2013；Zhang 2015)。最近的研究发现，OsMKK4功能的缺失导致小粒(Duan et al,2014)。OsMAPK6也在粒型的调控中起到正调控的作用(Liu et al,2015)。OsMKK4可以与OsMAPK6互作并且磷酸化OsMAPK6(Liu et al,2015)，并且这两个蛋白可以影响油菜素内酯(BR)的响应，可以调控BR相关基因的表达。这说明不同的粒型调控通路之间是有关联的。
[0004]在植物激素调控水稻粒型的网络中，发挥主要作用的激素有油菜素内酯、生长素、细胞分裂素等。其中油菜素内酯是一类多羟基甾体植物激素，对植物生长发育过程中多种生理过程的合理调控起到至关重要的作用。BR缺乏突变体dwarf1和dwarf2会产生小而短的籽粒，说明BR可以促进籽粒的生长(Hong et al,2005；Fang et al,2016)。BR被定位在膜上
面的受体复合物BRI1-BAK1感知，进一步使BIN2失活，激活两个转录因子BZR1和BZR2对下游基因的转录调控(Clouse 2011)。在水稻中，OsBRI1和OsBAK1的功能缺失导致BR钝感的表型并且籽粒变小(Morinaka et al,2006)。而过表达OsBZR1会增长水稻粒长、粒宽和粒重(Zhu et al,2015)。BIN2的同源基因OsGSK2负调控水稻粒型(Tong et al,2012)。在水稻中，OsGSK2可以磷酸化正调控因子OsDLT(Tong et al,2012)。qGL3是控制粒长的一个主效QTL，编码一个丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(OsPPKL1)，含有两个Kelch结构域。水稻中还有OsPPKL1的两个同系物OsPPKL2和OsPPKL3。OsPPKL1和OsPPKL3会抑制籽粒长度，而OsPPKL2作为拟南芥AtBSU1和AtBSL1的同系物起到促进籽粒伸长的作用。研究OsPPKLs是否通过BR信号途径调控水稻粒长具有重要意义。我们利用qGL3/OsPPKL1作为诱饵蛋白筛选水稻幼穗cDNA表达文库，得到了一个编码腺苷酸激酶的基因OsAK3。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于公开一个控制水稻籽粒粒长的基因OsAK3的克隆与水稻粒长性状的基因工程应用。过量表达水稻基因OsAK3可以增加水稻粒长，利于水稻粒型的遗传改良。OsAK3功能缺失突变体籽粒粒长变短，株高变矮，分蘖数减少，可用于水稻产量性状的遗传改良。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供水稻基因OsAK3，所述OsAK3基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述水稻基因OsAK3的编码区位于SEQ ID NO.1所示cDNA序列的154bp～879bp，全长726bp。
[0007]所述水稻基因OsAK3编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供含有前述水稻基因OsAK3的编码区的过量表达载体。
[0009]进一步的，所述的过量表达载体是将前述水稻OsAK3基因的编码区插入植物双元表达载体pCAMBIA1300s的Kpn
ꢀⅠ
和Sal
ꢀⅠ
酶切位点间所得。
[0010]本专利技术的第三个目的是提供前述水稻基因OsAK3或前述水稻基因OsAK3的过量表达载体在基因工程中的应用。
[0011]本专利技术的第四个目的是提供前述水稻基因OsAK3或前述水稻基因OsAK3的过量表达载体在通过基因工程手段改良水稻粒长中的应用。
[0012]进一步的，过量表达所述水稻基因OsAK3，能够增加水稻的粒长。
[0013]进一步的，将水稻基因OsAK3的过量表达载体导入水稻，提高水稻基因OsAK3的表达，能够增加水稻的粒长。
[0014]进一步的，前述应用具体包括以下步骤：
[0015](1)提取水稻品种“DJ”的总RNA，反转录合成cDNA第一链；
[0016](2)水稻基因OsAK3的克隆：
[0017]以步骤(1)反转录合成的cDNA第一链为模板，采用引物对：
[0018]OsAK3F：5
’-
TTGTCACCGTCTCACCAG-3
’
(SEQ ID NO.3)，
[0019]OsAK3R：5
’-
CAGAAGGAATACCCTGTCAAGATT-3
’
(SEQ ID NO.4)进行PCR扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.水稻基因OsAK3，其特征在于，所述OsAK3基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的水稻基因OsAK3，其特征在于，所述水稻基因OsAK3的编码区位于SEQ ID NO.1所示序列的154bp～879bp。3.权利要求1或2所述水稻基因OsAK3编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.含有权利要求1或2所述的水稻基因OsAK3的编码区的过量表达载体。5.根据权利要求4所述的过量表达载体，其特征在于，所述的过量表达载体是将权利要求1所述水稻OsAK3基因的编码区插入植物双元表达载体pCAMBIA1300s的Kpn
ꢀⅠ
和Sal
ꢀⅠ
酶切位点间所得。6.权利要求1所述的水稻基因OsAK3或权利要求4所述水稻基因OsAK3的过量表达载体在基因工程中的应用。7.权利要求1所述的水稻基因OsAK3或权利要求4所述水稻基因OsAK3的过量表达载体在通过基因工程手段改良水稻粒长中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，过量表达所述水稻基因OsAK3，能够增加水稻的粒长。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将水稻基因OsAK3的过量表达载体导入水稻，提高水稻基因OsAK3的表达，能够增加水稻的粒长。10.根据权利要求7至9任一项所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取水稻品种“DJ”的总RNA，反转录合成cDNA第一链；(2)水稻基因OsAK3的克隆：以步骤(1)反转录合成的cDNA第一链为模板，采用引物对：OsAK3F：5
’-
TTGTCACCGTC...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄骥，张佳琪，高秀莹，唐海娟，张红生，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：