本发明专利技术涉及奈必洛尔在制备MCR-1酶抑制剂中的应用。本发明专利技术通过微量肉汤稀释法验证了奈必洛尔能够恢复多粘菌素对mcr-1阳性大肠杆菌的抗菌活性。进一步通过薄层色谱法证明了奈必洛尔能够抑制MCR-1蛋白对磷酸乙醇胺的转移活性。因此，将奈必洛尔与多粘菌素联合应用，为mcr-1阳性耐药菌的治疗新策略提供了实验基础，对于解决耐药性问题具有重要的研究价值。对于解决耐药性问题具有重要的研究价值。
【技术实现步骤摘要】
奈必洛尔在制备MCR-1酶抑制剂中的应用
[0001]本专利技术公开了奈必洛尔的一种新的用途，涉及奈必洛尔在制备MCR-1酶抑制剂中的用途，属于医学制药
技术介绍
[0002]当前，细菌耐药问题严重威胁着人类健康，在全球范围内，每年因多重耐药菌感染而引起的死亡人数高达700,000。由于新型抗生素开发乏力，使得多粘菌素这一古老抗生素重新应用于临床，并被视为抵御某些耐药菌所致感染的最后一道药物防线。
[0003]多粘菌素是从多黏类芽孢杆菌的培养液中分离得到的，分为A、B、C、D、E五种类型，其中，多粘菌素B和多粘菌素E(黏菌素)用于临床。过去认为多粘菌素耐药主要是由染色体突变介导的，故不易引起耐药菌的广泛传播。但在2015年末，我国学者首次报道了由质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1，其可编码磷酸乙醇胺转移酶，将磷酸乙醇胺(PEA)基团添加到脂多糖表面的类脂A上，减少脂质A的负电荷，影响黏菌素与细菌的静电作用，从而导致细菌对黏菌素耐药。
[0004]由于质粒能够自我复制并在细菌间转移，所以mcr-1的出现可能导致多粘菌素耐药的发展更为快速。目前，mcr-1基因已经在50余个国家被发现，不仅在动物样品(鸡、鸭、牛等)中发现，在环境样品(蔬菜、食品、水)、临床分离样本、健康群体(包括婴儿)内也有发现，且已扩散到多种肠杆菌科细菌中，如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、沙门菌等，更为严重的是，mcr-1与其他超级耐药基因NDM-1、NDM-5、NDM-9共存形成泛耐药也见报道。其流行情况不容乐观。
[0005]当前，关于MCR-1抑制剂鲜有报道，因此，开发安全有效的MCR-1抑制剂对恢复mcr-1阳性耐药菌对多粘菌素的敏感性具有重要的意义。奈必洛尔为β1受体拮抗剂，用于治疗高血压、充血性心力衰竭等。但截至目前国内外未见奈必洛尔在制备MCR-1抑制剂中的相关报道。
技术实现思路
[0006]本专利技术提供了一种奈必洛尔在制备MCR-1酶抑制剂中的医药用途，公开了奈必洛尔能够抑制MCR-1酶的活性，恢复mcr-1阳性大肠杆菌对多粘菌素的敏感性。
[0007]本专利技术通过微量肉汤稀释法验证奈必洛尔能够恢复多粘菌素对mcr-1阳性大肠杆菌的抗菌活性。进一步通过薄层色谱法(TLC)证明奈必洛尔能够抑制MCR-1蛋白对磷酸乙醇胺的转移活性。
[0008]本专利技术的积极效果在于：
[0009]提供了奈必洛尔在制备MCR-1酶抑制剂中的新医药用途，公开了奈必洛尔能够抑制MCR-1酶的活性，恢复mcr-1阳性大肠杆菌对多粘菌素的敏感性。将奈必洛尔与多粘菌素联合应用，为mcr-1阳性耐药菌的治疗新策略提供了实验基础，使得多粘菌素能够更好地发挥作用，对于解决耐药性问题具有进一步的研究价值。
附图说明
[0010]图1为本专利技术奈必洛尔对MCR-1蛋白的PEA转移活性的抑制效果。
具体实施方式
[0011]通过下面的实施例可以对本专利技术进行进一步的描述。然而，本专利技术的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本专利技术的精神和范围的前提下，对本专利技术进行的各种变化和修饰仍处于本专利技术的权利要求范围之内。
[0012]本专利技术所述的奈必洛尔购自Selleck公司，其分子式：C
22
H
25
F2NO4.HCl，分子量：441.9，CAS号：152520-56-4；黏菌素硫酸盐购自百灵威科技有限公司；BL21(DE3)购自优宝生物；表达mcr-1的BL21(DE3)由生工生物工程(上海)股份有限公司构建；NBD-glycerol-3-PEA购自美国Avanti Lipids。
[0013]实施例1 奈必洛尔对细菌生长的影响
[0014]1.样品处理：将奈必洛尔溶于DMSO，用培养液配成适宜初始浓度，再用培养液2倍稀释，共4个稀释度。
[0015]2.菌悬液制备：将BL21(DE3)和表达mcr-1的BL21(DE3)于LB平板复苏，分别挑取单菌落于MH培养基中增菌。
[0016]3.测试方法：将1
×
106c.f.u.ml-1
菌液接种于96孔培养板，每孔50μL，再加入50μL的奈必洛尔溶液。菌液的终浓度为5
×
105c.f.u.ml-1
，奈必洛尔的终浓度为62.5μM，125μM，250μM和500μM。同时设置对照，为同体积的只加菌液的对照孔。37℃培养16h，于黑暗背景下肉眼观察96孔板中有无细菌生长。
[0017]4.测试结果：结果显示，在化合物浓度为500μM时，孔中菌液呈混浊状态，即细菌仍然能够正常生长，说明化合物自身对细菌无毒害作用。
[0018]实施例2 奈必洛尔联合2μg
·
mL-1
黏菌素对表达mcr-1的BL21(DE3)的抗菌活性
[0019]1.样品处理：将奈必洛尔溶于DMSO，用培养液配成适宜初始浓度，再用培养液2倍稀释，共4个稀释度。
[0020]2.菌悬液制备：将表达mcr-1的BL21(DE3)于LB平板复苏，分别挑取单菌落于MH培养基中增菌。
[0021]3.测试方法：将1
×
106c.f.u.ml-1
菌液接种于96孔培养板，每孔50μL，将25μL的奈必洛尔溶液加至相应的孔中，再加入25μL的黏菌素溶液。菌液的终浓度为5
×
105c.f.u.ml-1
，奈必洛尔的终浓度为12.5μM，25μM，50μM，100μM，黏菌素的终浓度为2μg
·
mL-1
。同时设置对照，为同体积的只加黏菌素的对照孔和只加化合物的对照孔。37℃培养16h，于黑暗背景下肉眼观察96孔板中有无细菌生长。
[0022]4.测试结果：结果显示，在奈必洛尔浓度为50μM时，孔中呈清亮状态，即表达mcr-1的BL21(DE3)恢复了对2μg
·
mL-1
黏菌素的敏感性。
[0023]实施例3 奈必洛尔对MCR-1蛋白活性的抑制作用
[0024]1.MCR-1蛋白表达质粒的构建：将mcr-1基因通过酶切位点Nde1/Xho1插入到质粒pET21a(+)中，通过测序来验证重组质粒是否构建成功。
[0025]2.MCR-1蛋白的表达：将重组质粒pET21a(+)-mcr-1转染至BL21(DE3)中进行细菌培养。从琼脂平板中挑取单菌落接种于含100μg
·
mL-1
氨苄西林的LB培养液中，37℃过夜培
养。将扩菌后的菌液按1∶100接种于LB培养液中，37℃培养至OD600达到0.6时，加入0.5mM IPTG，18℃培养过夜。低速离心取沉淀，1
×
PBS洗菌后，-80℃储存。
[0026]3.MCR-1蛋白的纯化：取上述菌体沉淀物，重悬于缓冲液中，使用高压连续流细胞破碎机破碎细胞释放蛋白质，高速离心后，收集上清液。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.奈必洛尔或其药用盐在制备MCR-1酶抑制剂中的应用。所述奈必洛尔如式I所示：2.如权利要求1所述的奈必洛尔在制备MCR-1酶抑制剂中的应用，其特征在于所述的奈必洛尔为药学上可接受的载体。3.如权利要求1所述的奈必洛尔在制备MCR-1酶抑制剂中的应用，其特征在于所述的应用为奈必洛尔在制...
【专利技术属性】
技术研发人员：李松，肖军海，兰秀娟，闫海涛，钟武，郑志兵，王晓奎，谢云德，曹瑞源，李行舟，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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