用包含NC-1-Fc的蛋白寡聚体治疗血管发生、纤维化和癌症相关疾病的手段和方法技术

本发明专利技术涉及生产包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC‑1‑Fc蛋白的蛋白寡聚体的方法，所述方法包括：a)在允许形成包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC‑1‑Fc蛋白的蛋白寡聚体的条件下培养表达(i)和(ii)的宿主细胞，所述(i)为融合蛋白，其从N‑至C‑端包含融合至具有“杵”突变的人IgG1 Fc的来自胶原蛋白18的人NC‑1，或融合至来自胶原蛋白18的人NC‑1的具有“杵”突变的人IgG1 Fc，所述(ii)为具有“臼”突变的人IgG1 Fc，其中(i)所述的融合蛋白和(ii)所述的具有“臼”突变的人IgG1 Fc以2∶1或更高的比例表达，以及b)获得包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC‑1‑Fc蛋白的蛋白寡聚体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用包含NC-1-Fc的蛋白寡聚体治疗血管发生、纤维化和癌症相关疾病的手段和方法本专利技术涉及生产包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的方法，所述方法包括：a)在允许形成包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的条件下培养表达(i)和(ii)的宿主细胞，所述(i)为融合蛋白，其从N-至C-端包含，融合至具有“杵”突变的人IgG1Fc的来自胶原蛋白18的人NC-1，或融合至来自胶原蛋白18的人NC-1的具有“杵”突变的人IgG1Fc，所述(ii)为具有“臼”突变的人IgG1Fc，其中(i)所述的融合蛋白和(ii)所述的具有“臼”突变的人IgG1Fc以2∶1或更高的比例表达，以及b)从步骤a)的所述宿主细胞中获得包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体。本专利技术进一步涉及生产包含至少两个，且优选三个单体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的方法，所述方法包括：a)在允许形成包含至少两个，且优选三个单体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的条件下培养表达融合蛋白的宿主细胞，所述融合蛋白从N-至C-端包含：融合至人IgG1Fc的来自胶原蛋白18的人NC-1，或融合至来自胶原蛋白18的人NC-1的人IgG1Fc，其中所述人IgG1Fc包含至少一个单体突变，优选地单体突变F405R，和一个或更多个半衰期延长突变，优选半衰期延长突变M252Y、S254T和T256E，以及b)从步骤a)的所述宿主细胞中获得包含至少两个，且优选三个单体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体。进一步地，本专利技术提供蛋白寡聚体，其包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白，所述蛋白寡聚体用于治疗、改善或预防与血管发生有关的疾病，其中所述异源二聚体人NC-1-Fc蛋白包含(i)融合蛋白，其从N-至C-端包含：融合至具有“杵”突变的人IgG1Fc的来自胶原蛋白18的人NC-1，或融合至来自胶原蛋白18的人NC-1的人IgG1Fc，和(ii)具有“臼”突变的人IgG1Fc，其中人IgG1Fc中的所述“杵”突变和“臼”突变是如本申请所限定的。本专利技术还涉及单体NC-1-Fc蛋白，其包含来自胶原蛋白18的人NC-1和来自人IgG1的Fc结构域，其中来自人IgG1的Fc结构域包含至少一个单体突变，优选地单体突变F405R，和一个或更多个半衰期延长突变，优选半衰期延长突变M252Y、S254T和T256E。本专利技术还涉及包含至少两个所述单体人NC-1-Fc融合蛋白的蛋白寡聚体，其用作药物，优选地用于治疗与血管发生有关的疾病、纤维化或与纤维化相关的疾病、血管内皮生长因子(VEGF)相关疾病或基质金属蛋白酶(MMP)相关疾病。由Folkman实验室(OReilly等，Cell88(2)：277-85，1997)1997年生产的原始重组内皮抑制素是在大肠杆菌中生成的不溶性聚集体，其被皮下注射至小鼠。随后，可溶性内皮抑制素在酵母中产生。Entremed单体内皮抑制素在关键的N-端Zn2+结合结构域中缺乏很大一部分。此种单体内皮抑制素在一期试验中显示出中等程度的反应，且生产成本很高，以至于仅进行了少量试验(有关综述，请参见AbdollahiDRU2015PMID:15939343)。中国科学家通过向N-端添加His标签来开发恩度(Endostar)，导致更好的增溶作用，并发现了一种重折叠程序以在细菌培养物中产生内皮抑制素单体，该内皮抑制素单体在非小细胞肺癌中有效(US7078485B2)并获得了中国FDA的批准。因此，即使内皮抑制素的生产也是一个挑战。Javaherian博士与Lexigen(后来的MerckKGa)一起开发了Fc-内皮抑制素，最初是为了规避两个障碍，即使用常规的成熟的抗体生产平台来提高大量内皮抑制素的表达以用于临床试验水平生产。此外，后来的研究揭示了更好的半衰期(Lee等CCR14(5):1487-93,2008)，其是Fc-内皮抑制素针对重组内皮抑制素分子的仅30分钟至1小时的半衰期的另一个论点。包括内皮抑制素结构域的胶原蛋白18NC-1的生产从一开始就是一个巨大的挑战，这是由于该分子在寡聚化结构域上的聚集。因此，没有关于重组NC-1功效的体内数据，并且对迄今为止被认为是内皮抑制素的前体分子仅进行了很少的研究。Javaherian博士和其他少数实验室能通过His标签或Flag标签表达很少的重组NC-1，但对于动物的临床前给药而言，这还远远不够。因此，与体内研究相关的NC-1量的产生仍然构成主要挑战。鉴于上述内容，本领域需要开发用于生产足够用于临床前和临床研究的量的NC-1的有效方法。可以将本专利技术所基于的技术问题视为提供符合上述需要的手段和方法。该技术问题已通过权利要求和下文中表征的实施方案解决。因此,本专利技术涉及生产包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的方法，所述方法包括：a)在允许形成包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的条件下培养表达(i)和(ii)的宿主细胞，所述(i)为融合蛋白，其从N-至C-端包含：融合至具有“杵”突变的人IgG1Fc的来自胶原蛋白18的人NC-1，或融合至来自胶原蛋白18的人NC-1的具有“杵”突变的人IgG1Fc，所述(ii)为具有“臼”突变的人IgG1Fc，其中(i)所述的融合蛋白和(ii)所述的具有“臼”突变的人IgG1Fc(ii)以2∶1或更高的比例表达，以及b)从步骤a)的所述宿主细胞中获得包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体。在本专利技术的该方法中，产生蛋白寡聚体。蛋白寡聚体包含至少两个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白，但也能够包含多于两个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白，例如三个、四个、五个、六个或甚至更多个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白质。优选地，蛋白寡聚体包含三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白质。图9说明了异源二聚体人NC-1-Fc蛋白和包含三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体。异源二聚体人NC-1-Fc蛋白包含(i)融合蛋白，所述融合蛋白从N-端到C端包含：融合至具有“杵”突变的人IgG1Fc的来自胶原蛋白18的人NC-1，或融合蛋白，所述融合蛋白从N-端到C端包含：融合至来自胶原蛋白18的人NC-1的具有“杵”突变的人IgG1Fc。Fc“杵臼”(KiH)策略是本领域众所周知的，并在本文其他地方进行了说明。如果来自胶原蛋白18的人NC-1位于融合蛋白的N端，且带有“杵”突变的人IgG1Fc位于融合蛋白的C端，那么所述融合蛋白(i)在本文中也称为“NC-1-Fc-杵”。因此，“Fc-杵-NC-1”对应一种融合蛋白，具有“杵”突变的人IgG1Fc位于所述融合蛋白的N端，而来自胶原蛋白18的人NC-1位于融合蛋白的C端。异源二聚体人NC-1-Fc蛋白进一步包含(ii)具有“臼”突变的来自IgG1的Fc结构域。所述Fc结构域(ii)在本文中也称为“Fc-臼”。包含(i)NC-1-Fc-杵或Fc-杵-N本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.生产包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的方法，所述方法包括：/na)在允许形成包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的条件下，培养表达(i)和(ii)的宿主细胞，所述(i)为融合蛋白，其从N-至C-端包含融合至具有“杵”突变的人IgG1 Fc的来自胶原蛋白18的人NC-1，或融合至来自胶原蛋白18的人NC-1的具有“杵”突变的人IgG1 Fc，所述(ii)为具有“臼”突变的人IgG1 Fc，其中(i)所述的融合蛋白和(ii)所述的具有“臼”突变的人IgG1 Fc以2∶1或更高的比例表达，以及/nb)从步骤a)的所述宿主细胞中获得包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180417 EP 18167832.71.生产包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的方法，所述方法包括：
a)在允许形成包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的条件下，培养表达(i)和(ii)的宿主细胞，所述(i)为融合蛋白，其从N-至C-端包含融合至具有“杵”突变的人IgG1Fc的来自胶原蛋白18的人NC-1，或融合至来自胶原蛋白18的人NC-1的具有“杵”突变的人IgG1Fc，所述(ii)为具有“臼”突变的人IgG1Fc，其中(i)所述的融合蛋白和(ii)所述的具有“臼”突变的人IgG1Fc以2∶1或更高的比例表达，以及
b)从步骤a)的所述宿主细胞中获得包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体。


2.权利要求1所述的方法，其进一步包括步骤c)，其中三聚体的形成通过交联非变性的异源二聚体人NC-1-Fc蛋白来测试。


3.权利要求1或2所述的方法，其中人IgG1Fc包含“杵”突变S354C/T366W，和具有“臼”突变Y349C/T366S/L368A/Y407V的人IgG1Fc。


4.权利要求1、2或3所述的方法，其中具有“杵”突变S354C/T366W的人IgG1Fc包含SEQIDNO:25，且具有“臼”突变Y349C/T366S/L368A/Y407V的人IgG1Fc包含SEQIDNO:26。


5.生产包含至少两个，且优选三个单体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的方法，所述方法包括：
a)在允许形成包含至少两个，且优选三个单体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体的条件下，培养表达融合蛋白的宿主细胞，所述融合蛋白从N-至C-端包含融合至人IgG1Fc的来自胶原蛋白18的人NC-1，或融合至来自胶原蛋白18的人NC-1的人IgG1Fc，其中所述人IgG1Fc包含至少一个单体突变，优选地单体突变F405R，和一个或更多个半衰期延长突变，优选半衰期延长突变M252Y、S254T和T256E，以及
b)从步骤a)的所述宿主细胞中获得包含至少两个，且优选三个单体人NC-1-Fc蛋白的蛋白寡聚体。


6.蛋白寡聚体，其包含至少两个，且优选三个异源二聚体人NC-1-Fc蛋白，所述蛋白寡聚体用于治疗、改善或预防血管发生相关疾病，其中所述异源二聚体人NC-1-Fc蛋白包含(i)融合蛋白，其从N-至C-端包含融合至具有“杵”突变的人IgG1Fc的来自胶原蛋白18的人NC-1，或融合至来自胶原蛋白18的人NC-1的人IgG1Fc，和(ii)具有“臼”突变的人IgG1Fc，其中人IgG1Fc中的所述“杵”突变和“臼”突变如权利要求3或4中定义。


7.如权利要求6所述用途的蛋白寡聚体，其中所述血管发生相关疾病选自由以下各项组成的组：血管发生依赖性癌症，包括实体瘤，黑素瘤，肿瘤转移瘤，血源性肿瘤，如白血病，良性肿瘤，如血管瘤，听神经瘤，神经纤维瘤，沙眼，化脓性肉芽肿；类风湿性关节炎；银屑病；眼部血管发生疾病如糖尿病性视网膜病变，早产儿视网膜病变，黄斑变性，角膜移植片排斥，新生血管性青光眼，晶状体后纤维组织形成，发红(rubeosis)；Osler-Webber综合征；心肌血管发生；斑块新血管形成；毛细管扩张；血友病关节；血管纤维瘤；伤口肉芽；过度或异常刺激内皮细胞的疾病如肠粘连，动脉粥样硬化，硬皮病，肥大性疤痕(疤痕疙瘩)；具有血管发生作为病理结果的疾病，例如猫抓病(Rocheleminaliaquintosa)和溃疡(幽门螺杆菌)。


8.单体NC-1-Fc蛋白，其包含来自胶原蛋白18的人NC-1和来自人IgG1的Fc结构域，其中来自人IgG1的Fc结构域包含至少一个单体突变，优选地单体突变F405R，和一个或更多个半衰期延长突变，优选半衰期延长突变M252Y、S254T和T256E。...

【专利技术属性】
技术研发人员：卡什·贾瓦海里恩，约根·德布斯，阿米尔·阿布多拉希，
申请(专利权)人：海德堡生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE