一种基于p53信号通路的药物筛选模型的构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种以P53为靶点的药物筛选细胞模型，利用含有P53特异性结合序列的报告系统载体，以具有野生型P53的活性细胞为基础构建而成。该模型用于筛选由野生型P53活化造成的肿瘤及免疫疾病的治疗药物，由于采用具有野生型P53活性的细胞，模型细胞中报告基因处于高度活化状态，无需使用外加刺激物，得到的稳定细胞模型可直接用于化合物的筛选；不仅大大降低了筛选的成本，同时也使整个筛选流程从细胞培养→激活P53→加化合物→检测简化为细胞培养→加化合物→检测，缩短了筛选的周期，减少了操作步骤，提升系统稳定性、高效性及易用性，更适用于高通量药物筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种基于p53信号通路的药物筛选模型的构建方法和应用
本专利技术属于医药领域，涉及一种以P53为靶点的药物筛选细胞模型，尤其涉及一种以具有野生型P53活性细胞为基础的药物筛选细胞模型；本专利技术同时还涉及该药物筛选细胞模型的构建方法和应用。
技术介绍
P53是一个肿瘤抑制蛋白，作为一个转录因子，P53由N端激活域、DNA中央特定结合域和C-端四聚体化域组成，而且其调控域富含碱性氨基酸。P53半衰期很短，在26S蛋白酶体作用下，通过持续的泛素化和后期蛋白酶降解，P53在无刺激的哺乳类动物细胞中维持较低的含量。去磷酸化的P53在MDM2(鼠双微体基因-2)泛素连接酶作用下被泛素化。通过使P53的失活，MDM2扮演着P53抑癌基因的主要监视者。当细胞面临着DNA损伤、缺氧、细胞因子、代谢改变、病毒感染或者致癌基因等刺激时，导致P53泛素化被抑制和P53在细胞核内积累，通过多个共价修饰包括磷酸化和乙酰化，P53被激活并稳定存在。在所有肿瘤中P53是最频繁突变的蛋白，据估计有60％的肿瘤有变异形式，影响其生长抑制活动。突变的P53伴随着基因组的不稳定和增加肿瘤发生的概率，一方面丧失了肿瘤抑制活性；另一方面突变后的蛋白会产生新的癌基因活性，从而促进了肿瘤的发展。而野生型的P53被认为具有对肿瘤发生的保护性作用。针对P53野生型肿瘤领域的药物研发，最重要的思路是靶向P53的反向调控蛋白MDM2和MDMX。通过抑制剂结合MDM2/MDMX，阻止其与P53的结合，从而抑制了P53蛋白的降解过程，提高了细胞内部P53的蛋白水平。P53蛋白水平的提高，可以诱导肿瘤细胞中P53发挥启动细胞凋亡和细胞周期阻止的功能，从而有效抑制肿瘤细胞的生长和存活。因此，P53成为肿瘤治疗中靶点选择的热门候选之一。基于上述原因，一直以来研究者们试图寻找特异性好，副作用低的野生型P53的激活剂，以最终用于临床，缓解和治疗数目庞大的相关患者；基于报告系统的高通量筛选方法虽已经出现并用于实践，取得了一定成效，但仍然有一些不可克服的缺点，比如需要外源刺激，这样不仅步骤多，而且筛选成本也较高，也会使报告系统的不稳定性增加(额外的操作必然会带来额外的不确定因素)。为此我们选取了基因背景上与肿瘤患者具有相似基因突变的肿瘤细胞系，建立Luciferase报告基因筛选系统。旨在利用这一模拟天然的P53信号通路基因突变图谱的永生化肿瘤细胞系筛选体系，筛选得到更具有临床应用价值的P53信号通路激活剂。此外，基于这一模拟环境下筛选得到的P53信号通路激活剂的研究，也可以通过对激活剂靶标的逆向寻找，探索肿瘤细胞中参与P53信号通路调节的蛋白的种类和功能，有利于发现新的靶标蛋白，扩展对P53信号通路更深刻的认识。
技术实现思路
本专利技术可提供一种以P53为靶点的药物筛选细胞模型。本专利技术可提供一种以P53为靶点的药物筛选细胞模型的构建方法。本专利技术还可提供一种以P53为靶点的药物筛选细胞模型在药物筛选中的应用方法。(一)以P53为靶点的药物筛选细胞模型根据已有文献中对P53通路的研究报告，发现选取了野生型P53细胞系HCT-116，MCF-7和A549作为候选细胞系，为了进一步验证选取了针对MDM2的抑制剂SAR405838靶向野生型P53细胞，作为阳性药物，用于检测给药后P53信号通路的变化。以突变型P53的抑制剂NSC59984靶向P53突变型细胞作为对照，附图2可以看到，野生型P53细胞HCT-116中，加入MDM2抑制剂可以有效提高P53蛋白水平，从而诱导下游p21蛋白的表达。并且，加入激活剂SAR405838后，P53活化体蛋白水平升高，说明这一活化信号受到阳性药物SAR405838的有效调节，可以用于后续的Luciferase模型构建。而突变型P53抑制剂对野生型细胞A549的P53信号通路影响较弱，说明抑制剂对突变型和野生型P53信号通路具有选择性，需要分别建立药物筛选系统。本专利技术以P53为靶点的药物筛选细胞模型，是利用含有P53特异性结合序列的报告系统载体，以具有野生型P53的活性细胞HCT-116、MCF-7和A549为基础，构建成稳定的以P53信号为靶点的高通量药物筛选细胞模型。所述P53的特异性结合序列为5’-GGCCTAACTGGCCGGTACCGCTAGCCTCGATACGTTTGCCTTGCCTGGACTTGCCTGGCCTTGCCTTGGACATGCCCGGGCTGTCGCGCGTAGATCTGCA-3’。所述报告系统载体是在含有荧光素酶报告基因的报告载体pGM-Lu中的多克隆位点中插入包含有P53特异性结合序列作为报告系统载体的响应序列构建成的报告系统载体。所述具有野生型P53活性细胞为一类具有持续活化P53活性的HCT-116、MCF-7和A549细胞。(二)以P53为靶点的药物筛选细胞模型的构建方法本专利技术以P53为靶点的药物筛选细胞模型的构建方法，包括以下工艺步骤：(1)Luciferase报告系统载体的构建：利用分子生物学方法在含有荧光素酶报告基因的报告载体pGM-Lu多克隆位点中插入包含有P53特异性结合序列，作为报告系统载体的响应序列，构建成报告系统载体。这样插入序列位于荧光素酶报告基因的上游，当P53活化时，便可增强荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译，从而增强了荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时即可检测到更强的荧光；激活P53活性时，荧光素酶报告基因的转录和荧光素酶翻译的水平都升高，也就增强细胞内荧光素酶的活性，加入荧光素酶底物时荧光强度也就增强。(2)细胞模型的构建：a)受体细胞系的选择：检测多种人源肿瘤细胞系中P53信号蛋白的表达活性，界定野生型活化的候选细胞系；b)蛋白水平检测P53通路活性：瞬时转染pGMP53-Lu质粒后，加入阳性药物检测Luciferase活性，调整转染方法、条件以及阳性药物或刺激因子的剂量、处理时间；将所述报告系统载体转染HCT-116、MCF-7和A549细胞中检测模型建立的可行性。附图2可以看到，HCT-116、MCF-7和A549细胞中瞬转pGMP53-Lu后，用G418进行阳性克隆筛选，产生明显的Luciferase活性，并且加入阳性药物SAR405838后，可以增强Luciferase活性。这说明，pGMP53-Lu可以在HCT-116、MCF-7和A549细胞中进行Luciferase转录，产生筛选活性。再经过3-4周的阳性单克隆的筛选得到单克隆细胞株即为以P53为靶点的药物筛选细胞模型。(三)以P53为靶点的药物筛选细胞模型的应用本专利技术以P53为靶点的药物筛选细胞模型具体药物筛选方法如下：(1)将所述药物筛选细胞模型用100μl培养基接种于96孔板中，培养至细胞汇合度为50％～60％；(2)培养基中加入待筛选化合物10μM，继续培养24小时；(3)在96孔板中加入10μl稳定型荧光素酶底物，使用酶标仪测定荧光强度并分析荧光激活率，当荧光激活率本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于p53信号通路的药物筛选模型的应用,其特征在于：利用含有P53特异性结合序列的报告系统载体，以具有野生型P53的活性细胞为基础，构建成稳定的以P53信号为靶点的高通量药物筛选细胞模型。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于p53信号通路的药物筛选模型的应用,其特征在于：利用含有P53特异性结合序列的报告系统载体，以具有野生型P53的活性细胞为基础，构建成稳定的以P53信号为靶点的高通量药物筛选细胞模型。


2.根据权利要求1所述的基于p53信号通路的药物筛选模型的应用,其特征在于:所述P53的特异性结合序列为5’-GGCCTAACTGGCCGGTACCGCTAGCCTCGATACGTTTGCCTTGCCTGGACTTGCCTGGCCTTGCCTTGGACATGCCCGGGCTGTCGCGCGTAGATCTGCA-3’。


3.根据权利要求1所述的基于p53信号通路的药物筛选模型的应用,其特征在于：所述报告系统载体是在含有荧光素酶报告基因的报告载体多克隆位点中插入包含有P53特异性结合序列作为报告系统载体的响应序列，构建成的报告系统载体。


4.根据权利要求1所述的基于p53信号通路的药物筛选模型的应用,其特征在于：所述具有野生型P53的活性细胞为选取了野生型P53细胞系HCT-116、MCF-7和A549作为候选细胞系。


5.根据权利要求1所述的基于p53信号通路的药物筛选模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：Luciferase报告系统载体的构建：
利用分子生物学方法在含有荧光素酶报告基因的报告载体pGM-Lu多克隆位点中插入包含有P53特异性结合序列，作为报告系统载体的响应序列，构建成报告系统载体，将人工合成的5’-GGCCTAACTGGCCGGTACCGCTAGCCTCGATACGTTTGCCTTGCCTGGACTTGCCTGGCCTTGCCTTGGACATGCCCGGGCTGTCGCGCGTAGATCTGCA-3’DNA片段，以KpnI和HindⅢ的酶切位点插入到报告载体pGM-Lu中，得到的报告系统载体命名为pGMP53...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴亚剑，刘乃玉，张斌，
申请(专利权)人：上海健卫莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31