水稻粒型相关基因OsLa1基因及其编码序列和应用制造技术

水稻粒型相关基因OsLa1基因及其编码序列和应用，属于分子生物学、基因工程技术领域。提供水稻粒型相关基因OsLa1基因及其编码序列。提供OsLa1基因在调控水稻粒型中的应用。OsLa1基因从水稻中分离得到，基因全长4409bp，DNA序列如SEQ ID NO：1所示；其cDNA编码区序列长1404bp，如SEQ ID NO.2所示；OsLa1基因编码467个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。与野生型水稻相比，过表达OsLa1的转基因水稻能够提高水稻的粒长，而Cas9转基因水稻粒长、粒宽明显减少，为高产优质水稻新品种培育提供新的目标基因资源。

【技术实现步骤摘要】
水稻粒型相关基因OsLa1基因及其编码序列和应用
本专利技术属于分子生物学、基因工程
，具体是涉及水稻粒型相关基因OsLa1基因及其编码序列和应用。
技术介绍
水稻(OryzasativaL.)是世界上最重要的粮食作物之一，全球50％以上人口以水稻为主食。随着世界人口的日益增长，工业化的发展使得可用的耕地面积越来越少，加上全球气候变化加剧，导致粮食安全问题日益严重。因此，培育高产优质的水稻新品种，就成为了解决粮食问题最有效的手段。水稻的产量构成主要由单位面积有效穗数、穗粒数和千粒重(XingandZhang,2010)决定。水稻粒型主要包括粒长、粒宽和粒厚三个组分，是影响粒重的关键因素之一，在灌浆程度理想的状态下，粒型直接决定水稻的粒重，一般来说，籽粒长度越长，宽度越宽，厚度越厚，籽粒就越重。La蛋白作为自身免疫性抗原起初被发现于患有系统性红斑狼疮和干燥综合征的人类患者体内(AlspaughandTan,1975)。虽然首次发现于人类，但后来的研究表明其同源基因广泛地存在于真核生物当中，包括酵母、昆虫、脊椎动物等，是一种高丰度表达的细胞核磷酸化蛋白(WolinandCedervall,2002)。La蛋白被证实与大部分初生的小RNA(smallRNAs)有关，包括tRNA前体、5SrRNA前体和U6小核RNA以及一部分病毒编码RNA(Kufeletal.,2000)La蛋白的特异性识别位点为3’-UUU-OH(Stefano1984)，因此包含这个结构域的RNA聚合酶III产生的前体转录本(pretRNA)和一部分RNA聚合酶II转录产生的小RNA前体均可以被La蛋白识别并结合。这一结合可以帮助这些新合成的小RNA免于被外切酶剪切(MaraiaandIntine，2002),起到协助装配、使其正确折叠的作用。这种La蛋白介导的稳定结构作用是pre-tRNAs的成熟途径所必需的，能够促进小RNA组装成功能性RNA－蛋白质复合物，并有助于某些小RNA在核内保留(Grimmetal.,1997)。因此，La蛋白在RNA合成过程中扮演了分子伴侣的角色。植物中，在拟南芥基因组数据库中用Lamotif结构域检索可得到8个La或者La的类似蛋白(Fleurdepineetal.,2007)。通过蛋白结构和系统发生上的比较，其中有两个可能是真正的La蛋白，即At4g32720(At32)和At1g79880(At79)，它们在植物整个生长发育的不同时期和不同调控条件下均有表达。At32可以恢复酿酒酵母La蛋白在非编码RNA合成中行使的核功能且可以结合包含3’-UUU-OH尾巴的小RNA。可以说La蛋白的核功能是由At32行使的，且在拟南芥中高度保守，所以将编码这一蛋白的基因命名为AtLa1。AtLa1是真正La蛋白在拟南芥中的同源基因，主要定位在细胞核核浆，核仁腔也偶有分布。拟南芥中AtLa1的缺失会导致胚胎致死的表型，早期球形胚时期晶胚发育不足。此外，突变的胚胎细胞呈现核仁肥大的表型，这表明AtLa1蛋白在胚胎发生时期发挥着重要作用。综上所述，水稻的粒型发育受多种因素的影响，而关于La蛋白能影响水稻粒型发育的研究尚不多，对其中的机制也不是十分的清楚。本专利技术通过分子生物学、基因工程等方法对OsLa1生物学功能进行了研究，进一步揭示了其在水稻粒型的生长发育中有着重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供水稻粒型相关基因OsLa1基因。本专利技术的第二目的在于提供水稻粒型相关基因OsLa1基因的编码序列。本专利技术的第三目的在于提供水稻粒型相关基因OsLa1在调控水稻粒型中的应用。所述水稻粒型相关基因OsLa1基因从水稻中分离得到，基因全长4409bp，DNA序列如SEQIDNO：1所示；其cDNA编码区序列长1404bp，如SEQIDNO.2所示；OsLa1基因编码467个氨基酸，氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。根据测序验证后的OsLa1基因全长CDNA序列信息构建了该基因的超表达载体，同时构建了CRISPR/Cas9载体，为序列表SEQNO：2中的第97-116位所示的DNA序列。为了确定该基因在细胞的表达部位，进一步构建了GFP载体，即根据GFP表达情况来确定基因的表达模式，如序列表SEQNO：2所示的DNA序列。本专利技术还提供了用于从水稻mRNA中通过反转录PCR克隆此基因OsLa1的引物序列，用来扩增水稻OsLa1基因的引物为：Os02g39700-CDS-F：ATGGCCGCCGCCACCGCGOs02g39700-CDS-R：CTAAGCAGCAGCTTCGACCTTC本专利技术还提供含有上述水稻OsLa1基因的载体。本专利技术还提供含有上述水稻OsLa1基因载体的宿主。优选地，所述宿主为真核细胞。更优选地，所述宿主为水稻。本专利技术还提供上述水稻OsLa1基因在调控水稻粒型中的应用；所述应用是利用转基因技术将编码水稻OsLa1的核苷酸序列转化到水稻中，以改变水稻粒型，具体方法如下：1)将水稻OsLa1基因的编码区或sgRNA片段连接于植物表达载体，形成含有水稻OsLa1基因的植物过表达或CRISPR/Cas9载体。2)将步骤1)中的植物过表达或CRISPR/Cas9载体转入农杆菌EHA105中，将含有过表达或CRISPR/Cas9载体的农杆菌侵染水稻愈伤，经过共培养、除菌、抗生素筛选和分化(大约4个月的时间)，获得水稻OsLa1基因的过表达和CRISPR/Cas9转基因植株。与野生型水稻相比，过表达OsLa1的转基因水稻能够提高水稻的粒长，而Cas9转基因水稻粒长、粒宽明显减少。本专利技术还提供了一种用于检测转基因水稻中表达量的方法，主要利用荧光定量PCR的方法。具体步骤为：取转基因水稻的叶片，用RNA提取试剂盒抽提水稻RNA，并用DNase1消化DNA，然后反转录形成cDNA，以其为模板进行荧光定量PCR进行分析。荧光定量PCR引物核苷酸序列为：qPCR—Os02g39700-F：GAGGATGGAAAAATGGTTGGqPCR—Os02g39700-R：TTGAGATATGGCGTGGTAGC本专利技术克隆了一个与水稻粒型发育相关的基因OsLa1(LOC_Os02g39700)，通过转化水稻本身，获得这个克隆的转基因植株。通过对转基因水稻的表型观察及研究，确定这个基因在水稻粒型生长发育过程中的作用，为高产优质水稻新品种培育提供新的目标基因资源。附图说明图1为水稻OsLa1的序列同源性分析。图2为过表达OsLa1转基因植株的PCR鉴定，P代表阳性对照，N代表阴性对照，M代表DNA分子Marker。图3为过表达转基因植株中OsLa1基因的表达量检测。图4为Cas9转基因植株的PCR鉴定，P代表阳性对照，N代表阴性对照，M代表DNA分子Marker。图5为Cas9转基因植株T0代突变类型分析。图6为OsLa1蛋白的瞬时表达定位。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.水稻粒型相关基因OsLa1基因，其特征在于其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。/n

【技术特征摘要】
1.水稻粒型相关基因OsLa1基因，其特征在于其DNA序列如SEQIDNO：1所示。


2.如权利要求1所述水稻粒型相关基因OsLa1基因，其特征在于其cDNA序列如SEQIDNO.2所示。


3.如权利要求1所述水稻粒型相关基因OsLa1基因的编码基因，其特征在于OsLa1基因编码467个氨基酸，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。


4.含有如权利要求1所述水稻粒型相关基因OsLa1基因的过表达载体。


5.一种CRISPR/Cas9载体，其特征在于其序列如序列表SEQNO：2中的第97-116位所示。


6.一种转化植物细胞，其特征在于包含如权利要求1所述水稻粒型...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈亮，崔玉超，郭鸿鸣，薛丹阳，郭迟鸣，郭小玲，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35