使用内源荧光测定佐剂化蛋白质浓度和吸附百分比的方法技术

提供了用于确定化合物(如蛋白质)在包含所述化合物的佐剂化复合物的组合物中的浓度的方法和系统。所述方法和系统一般包括：(i)测量包含所述化合物的佐剂化复合物的组合物的内源荧光，以及(ii)将测得的荧光强度值与使用已知浓度的化合物绘制的校准曲线进行比较。还提供了用于确定选择的化合物对佐剂的吸附百分比的方法和系统。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用内源荧光测定佐剂化蛋白质浓度和吸附百分比的方法
技术介绍
疫苗制剂中抗原的浓度是关键参数，需要对其进行控制以确保生产过程和产品质量的一致性。由于多种原因，诸如控制制剂的准确性，估算与工艺有关的损失，监测产品的均质性，以及确保抗原对给定佐剂的适当吸附[1,2]，监测该制剂生产过程中抗原的浓度也很重要。蛋白基的疫苗制剂通常被制成悬浮液或乳剂，因此其包含佐剂如铝盐(即AlOOH、AlPO4等)或角鲨烯乳剂(即角鲨烯AS03、MF59等)。尽管佐剂通常是疫苗制剂的关键组分[3-5]，但佐剂的存在会对常用的蛋白质定量方法产生重大干扰，例如由于佐剂颗粒引起的浊度。已经公开了许多方法用于分析包含铝盐的疫苗制剂中存在的抗原，但是由于制剂的浊度，此类方法需要在测试前进行抗原解吸[6-8]。文献中描述的解吸程序相当复杂且耗时，以及可变的回收率和可疑的重现性[9,10]。报道的用于佐剂化(adjuvanted)疫苗中抗原定量的其他方法，如流式细胞术[11]、化学发光氮检测[12]、微量凯氏定氮法[13]和邻苯二甲醛测定[9]可以直接应用于悬浮液。但是，这些方法大多具有破坏性，还需要特异性抗体或特殊试剂，因此不适合用于快速周转或在位(in-line)过程监控。目前，也没有在位方法来测量佐剂化疫苗制剂的吸附百分比。显然，需要新的非破坏性方法来准确和可重现地确定疫苗制剂中佐剂化抗原的浓度。专利技术概述本专利技术涉及旨在克服与准确和可重现地确定包含佐剂化抗原的疫苗制剂中抗原浓度有关的问题的新方法。本文所述的方法克服了诸如待评估疫苗制剂中佐剂化抗原样品中的浊度干扰的问题。本文描述的方法是基于专利技术人的发现，即当抗原与佐剂一起配制时，可以测量和定量蛋白质的内源荧光(intrinsicfluorescence，IF)。如本文所报道的，包含某些芳香族氨基酸的蛋白质的内源荧光可以用于测量它们在大多数混合物中的浓度，即使是那些包含铝盐佐剂的混合物，也不需要从佐剂中解吸蛋白质。该发现已经延伸到使用内源荧光来精确测量选择的化合物的制剂，其中所述制剂包含所述选择的化合物的佐剂化复合物，并且其中所述选择的化合物包含至少一种芳香族氨基酸。在以下段落中简要总结了本专利技术，其包括但不限于几个实施方案及其特定方面。因此，在第一实施方案中，本专利技术涉及用于确定选择的化合物在包含所述选择的化合物的佐剂化复合物的组合物中浓度的方法。在该实施方案中，所述方法包括：(a)获得包含选择的化合物的佐剂化复合物的组合物的荧光强度值，其中所述选择的化合物包含至少一种芳香族氨基酸，并且其中所述组合物在250-300nm的波长被激发，并在300-500nm的波长确定发射光谱以获得所述组合物的荧光强度值；以及(b)将(a)中获得的荧光强度值与使用至少三个校准样品的荧光强度值绘制的校准曲线进行比较，从而确定所述选择的化合物在包含所述选择的化合物的佐剂化复合物的组合物中的浓度，所述校准样品包含不同已知浓度的代表所述选择的化合物的代表性化合物。在该实施方案的某些方面，使用至少三个包含不同已知浓度的代表性化合物的校准样品绘制(b)的校准曲线，其中所述校准样品中的代表性化合物在250-300nm的波长被激发，并且其中对于每个校准样品在300-500nm的波长确定发射光谱。在该实施方案的某些方面，使用至少五个包含不同已知浓度的代表性化合物的校准样品绘制(b)的校准曲线。在该实施方案的某些方面，通过下述步骤绘制(b)的校准曲线：(a)制备至少五个代表性化合物的校准样品，所述代表性化合物的浓度代表包含所述选择化合物的佐剂化复合物的组合物中的所述选择的化合物的疑似浓度的约50％、75％、100％、125％和150％；(b)使用250-300nm的波长激发(a)的每个校准样品；(c)使用300-500nm的波长确定(b)的每个样品的发射光谱，对于每个校准样品所述波长产生最大荧光强度；(d)绘制在产生最大荧光强度的波长处的荧光强度值相对于校准样品中代表性化合物的浓度的曲线，从而绘制代表性化合物的校准曲线。在该实施方案的某些方面，使用280-290nm的激发波长来实施各种方法，并在320-360nm的波长确定发射光谱。在第二实施方案中，本专利技术涉及确定选择的化合物在包含所述选择的化合物的佐剂化复合物的组合物中的吸附百分比(％)的方法。在该实施方案中，所述方法包括：(a)获得包含选择的化合物的佐剂化复合物的组合物的两个测试样品，其中所述选择的化合物包括至少一种芳香族氨基酸，其中在第一测试样品中所述佐剂化复合物基本上在溶液中，并且其中在第二测试样品中所述佐剂化复合物基本上从溶液中沉淀出来；(b)通过下述步骤确定第一测试样品中所述选择的化合物的浓度：(i)获得第一测试样品的荧光强度值，其中第一测试样品在250-300nm的波长被激发，并在300-500nm的波长确定发射光谱以获得所述第一测试样品的荧光强度值；以及(ii)将所述荧光强度值与使用至少三个校准样品绘制的校准曲线进行比较，从而确定第一测试样品中所述选择的化合物的浓度，所述校准样品包含不同已知浓度的代表所选化合物的代表性化合物；(c)通过下述步骤确定第二测试样品上清液中所述选择的化合物的浓度：(i)获得第二测试样品上清液的荧光强度值，其中第二测试样品上清液在250-300nm的波长被激发，并在300-500nm的波长确定发射光谱以获得所述第二测试样品上清液的荧光强度值；以及(ii)将所述荧光强度值与使用至少三个校准样品绘制的校准曲线进行比较，从而确定第二测试样品中所述选择的化合物的浓度，所述校准样品包括不同已知浓度的代表所述选择的化合物的代表性化合物；以及(d)将在(c)中确定的浓度除以在(b)中确定的浓度以计算吸附百分比(％)，从而确定选择的化合物在包含所述选择的化合物的佐剂化复合物的组合物中的吸附百分比(％)。在该实施方案的某些方面，使用至少三个包含不同已知浓度的代表性化合物的校准样品绘制(b)和/或(c)的校准曲线，其中所述校准样品中的代表性化合物在250-300nm的波长被激发，并且其中对于每个校准样品在300-500nm的波长确定发射光谱。在该实施方案的某些方面，使用至少五个包含不同已知浓度的代表性化合物的校准样品绘制(b)和/或(c)的校准曲线。在该实施方案的某些方面，通过下述步骤绘制(b)和/或(c)的校准曲线：(a)制备至少五个代表性化合物的校准样品，所述代表性化合物的浓度代表第二测试样品中基本上从溶液中沉淀出来的佐剂化复合物的疑似浓度的约50％、75％、100％、125％和150％；(b)使用250-300nm的波长激发(a)的每个校准样品；(c)使用300-500nm的波长确定(b)的每个样品的发射光谱，对于每个校准样品所述波长产生最大荧光强度；(d)绘制在产生最大荧光强度的波长处的荧光强度值相对于校准样品中代表性化合物的浓度的曲线，从而绘制代表性化合物的校准曲线。在该实施方案的某些方面，使用280-290nm的激发波长来实施各种方法，并在320本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于确定选择的化合物在包含所述选择的化合物的佐剂化复合物的组合物中的浓度的方法，所述方法包括：/n(a)获得包含选择的化合物的佐剂化复合物的组合物的荧光强度值，其中所述选择的化合物包括至少一种芳族氨基酸，并且其中所述组合物在250-300nm的波长被激发，并在300-500nm的波长确定发射光谱，以获得所述组合物的荧光强度值；以及/n(b)将(a)中获得的荧光强度值与使用至少三个校准样品的荧光值绘制的校准曲线进行比较，从而确定所述选择的化合物在包含所述选择的化合物的佐剂化复合物的组合物中的浓度，所述校准样品包含不同已知浓度的代表所述选择的化合物的代表性化合物。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180320 US 62/645,3671.用于确定选择的化合物在包含所述选择的化合物的佐剂化复合物的组合物中的浓度的方法，所述方法包括：
(a)获得包含选择的化合物的佐剂化复合物的组合物的荧光强度值，其中所述选择的化合物包括至少一种芳族氨基酸，并且其中所述组合物在250-300nm的波长被激发，并在300-500nm的波长确定发射光谱，以获得所述组合物的荧光强度值；以及
(b)将(a)中获得的荧光强度值与使用至少三个校准样品的荧光值绘制的校准曲线进行比较，从而确定所述选择的化合物在包含所述选择的化合物的佐剂化复合物的组合物中的浓度，所述校准样品包含不同已知浓度的代表所述选择的化合物的代表性化合物。


2.根据权利要求1所述的方法，其中使用至少三个包含不同已知浓度的代表性化合物的校准样品来绘制(b)的校准曲线，其中所述校准样品中的代表性化合物在250-300nm的波长被激发，并且其中对于每个校准样品在300nm-500nm的波长确定发射光谱。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中使用至少五个包含不同已知浓度的代表性化合物的校准样品来绘制(b)的校准曲线。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中通过下述步骤绘制(b)的校准曲线：
(a)制备至少五个代表性化合物的校准样品，所述代表性化合物的浓度代表包含所述选择的化合物的佐剂化复合物的组合物中的所述选择的化合物的疑似浓度的约50％、75％、100％、125％和150％；
(b)使用250-300nm的波长激发(a)的每个校准样品；
(c)使用300-500nm的波长确定(b)的每个样品的发射光谱，所述波长为每个校准样品产生的最大荧光强度；
(d)绘制产生最大荧光强度的(c)的波长处的荧光强度值相对于校准样品中所述代表性化合物浓度的曲线，从而绘制所述代表性化合物的校准曲线。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述选择的化合物选自：肽、多肽、蛋白质、多糖-蛋白质结合物、病毒样颗粒或病毒悬浮液。


6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述代表性化合物与所述选择的化合物相同。


7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述代表性化合物与所述选择的化合物具有至少90％的序列同一性。


8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述代表性化合物是所述代表性化合物的佐剂化复合物。


9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述激发波长为280-290nm，并在320-360nm的波长确定发射光谱。


10.用于确定选择的化合物在包含所述选择的化合物的佐剂化复合物的组合物中的吸附百分比(％)的方法，所述方法包括：
(a)获得包含选择的化合物的佐剂化复合物的组合物的两个测试样品，其中所述选择的化合物包括至少一种芳香族氨基酸，其中在所述第一测试样品中所述佐剂化复合物基本上在溶液中，并且其中在所述第二测试样品中所述佐剂化复合物基本上从溶液中沉淀出来；
(b)通过下述步骤确定所述选择的化合物在所述第一测试样品中的浓度：(i)获得所述第一测试样品的荧光强度值，其中所述第一测试样品在250-300nm的波长被激发，并在300-500nm的波长确定发射光谱以获得所述第一测试样品的荧光强度值；以及(ii)将所述荧光强度值与使用至少三个校准样品绘制的校准曲线进行比较，从而确定所述选择的化合物在第一测试样品中的浓度，所述校准样品包含不同已知浓度的代表所述选择的化合物的代表性化合物；
(c)通过下述步骤确定所述选择的化合物在所述第二测试样品上清液中的浓度：(i)获得所述第二测试样品上清液的荧光强度值，其中所述第二测试样品上清液在250-300nm的波长被激发，并在300-500nm的波长确定发射光谱以获得所述第二测试样品上清液的荧光强度值；以及(ii)将所述荧光强度值与使用至少三个校准样品绘制的校准曲线进行比较，从而确定所述选择的化合物在所述第二测试样品中的浓度，所述校准样品包含不同已知浓度的代表所述选择的化合物的代表性化合物；以及
(d)将在(c)中确定的浓度除以在(b)中确定的浓度以计算吸附百分比(％)，从而确定选择的化合物在包含所述选择的化合物的佐剂化复合物的组合物中的吸附百分比(％)。


11.根据权利要求10所述的方法，其中使用至少三个包含不同已知浓度的代表性化合物的校准样品绘制(b)和/或(c)的校准曲线，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·F·奥萨，C·罗克，K·A·斯特拉伦多夫，N·拉赫曼，
申请(专利权)人：赛诺菲巴斯德有限公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA