防止外显子7和/或外显子8包含到淀粉样前体蛋白(APP)mRNA中制造技术

本发明专利技术涉及神经退行性病症，并且具体地涉及用于治疗这种病状，例如阿尔茨海默病的新颖寡核苷酸。本发明专利技术提供新颖反义寡核苷酸和包括这种寡核苷酸的组合物以及用于治疗神经退行性病症的疗法和方法。本发明专利技术包含基因组编辑技术，以实现与使用新颖反义寡核苷酸类似的结果。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】防止外显子7和/或外显子8包含到淀粉样前体蛋白(APP)mRNA中本专利技术涉及神经退行性病症，并且具体地涉及用于治疗这种病状，例如阿尔茨海默病的新颖寡核苷酸。本专利技术尤其涉及新颖反义寡核苷酸，并且涉及包括这种寡核苷酸的组合物，并且涉及用于治疗神经退行性病症的疗法和方法。本专利技术扩展到基因组编辑技术的用途，其用于实现与使用新颖反义寡核苷酸类似的结果。mRNA的替代性剪接是脑部复杂性的主要因素[1]。即使尚不完全了解替代性剪接的mRNA转录物的精确功能和作用，但这些替代性剪接的mRNA中的一些替代性剪接的mRNA已经与神经退行性脑部病症的表现和/或进展联系起来[2]。最常见的神经退行性脑部病症是阿尔茨海默病(AD)，并且根据阿尔茨海默症协会(Alzheimer'ssociety)，全世界有3600万人患有AD，并且此数字预计每20年翻一番。在AD中，神经元的功能特性逐渐衰退，其中神经元的突出、连接显著丧失，并且最终神经元变性。据信，衰老、遗传和环境因素的混合物有助于疾病的表现和进展[3]。AD脑的特性表型是由淀粉样β(Aβ)肽的沉积构成的细胞外淀粉样斑块的存在。这些肽作为淀粉样前体蛋白(APP)的蛋白质水解加工的副产物产生，并且被认为是疾病的显著因素[4]。人类的APP由18个外显子[3]的单个基因编码，所述单个基因定位于染色体21q21.3[56]上并且在许多组织类型中表达[7]。APP属于具有大的细胞外结构域和小的细胞质尾区的I型单通跨膜蛋白家族[8，9]。APPmRNA的差异剪接产生若干剪接变体，其中主要同种型产生695、751和770个氨基酸的蛋白。APP695和APP751同种型是分别由外显子7(APP751)或外显子7和8(APP695)剪接而产生的，而APP770含有这两个外显子[10，11]。外显子7编码库尼茨(Kunitz)型蛋白酶抑制剂结构域(KPI)，并且外显子8编码与胸腺源性淋巴细胞的OX-2抗原共享同源性的结构域[10，11]。尽管APP被普遍表达，但不同的mRNA变体在不同的细胞类型中以不同的量表达。非神经元细胞主要表达APP751和770[12]，而神经元内的APP695被发现大量存在[8]。然而，在衰老的脑部或AD患者的脑部中，并且响应于NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体刺激，APP695减少，并且更长的同种型增加[13-20]。进一步支持同种型表达的改变对AD的进展具有重要意义的假说来自示出以下的报道：在AD患者中，调节多聚嘧啶段结合蛋白PTBP1(负责从APP的mRNA中排除外显子7和8的异质性核内核糖核蛋白)的微RNA(miR-124)的表达减少[21]。尽管APP的剪接模式在AD中似乎有所变化，但三种不同同种型的精确功能仍不清楚。然而，有证据表明在病理学病状下不同同种型的表达水平发生了改变。例如，NMDA谷氨酸受体的延长的活化会增加APP751而不是APP695的水平，从而还增加Aβ的水平[22]。有趣的是，进一步表明APP695的表达向APP751同种型的改变先于Aβ水平的增加，这表明Aβ的累积与APP751同种型的增加相关[13,23，24]。证据进一步示出APP695的表达减少与AD的进展相连，还示出Aβ以及APP细胞内结构域(AICD)(即APP的两种非常重要的蛋白质水解产物)都是由APP695优先产生的[25]。这是令人惊讶的，因为AD患者中APP695的减少还将表明Aβ肽的累积减少。即使Aβ的产生增加，APP695的减少如何可以有助于AD进展的可能解释来自示出以下的报道：来自细胞内AICD片段的核定位和基因表达的随后调节与APP695通过淀粉样蛋白途径的加工相连[25-28]。一旦处于细胞核中，AICD就会取代如脑啡肽酶(NEP)等靶基因上的组蛋白去乙酰化酶，所述脑啡肽酶(NEP)是负责Aβ降解的锌依赖性金属蛋白酶。[25]。这些数据表明，通过APP695的蛋白质水解加工产生的AICD片段调节可能潜在抵抗Aβ毒性作用的基因的表达。在这种情况下，AD患者中APP751的水平升高可能不会通过诱导APP的淀粉样蛋白加工来触发Aβ累积，而是通过调节基因转录来破坏Aβ水平的稳态调节，从而增强其毒性。鉴于上述情况，因此需要提供用于治疗如阿尔茨海默病等神经退行性病症的经过改进的疗法。如实例中所描述的，专利技术人已经研究了互补的、经过修饰的反义寡核苷酸(AON)如何可以靶向APPmRNA的加工以通过外显子跳读来促进外显子7和8的排除。专利技术人设计了与外显子7和8内的各个位点互补且还位于外显子7和8的剪接接合点周围的磷酸二酰胺吗啉代寡聚体(PMO)，并在人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中对其进行测试，以标识最佳的候选序列。值得注意的是，结果示出48小时后在mRNA水平下，外显子7和8完全跳读，以及72小时后在蛋白质水平下，较短的同种型APP695显著增加。这些结果表明，使用反义寡核苷酸改变APPmRNA的加工以为AD提供替代性治疗方法的可行性。因此，在本专利技术的第一方面，提供了一种反义寡核苷酸(AON)，所述AON能够减少或防止外显子7和/或外显子8包含到通过从淀粉样前体蛋白(APP)转录物剪接而产生的APPmRNA中。有利地，并且优选地，实例描述了可以如何使用根据第一方面所述的AON来促进外显子跳读以增加APP695mRNA同种型的表达，并减少APP751同种型和APP770同种型的量。主要目标是设计靶向APP的两个替代性剪接外显子(即外显子7和8)的AON。专利技术人设计了靶向外显子7的五种AON和靶向外显子8的四种AON。选择最有效PMO中的两个PMO，每个外显子各一个(PMO7.2和PMO8.2)，并且专利技术人示出，即使在相对低的AON浓度下也有可能令人惊讶地实现所靶向外显子的100％跳读。此外，专利技术人还示出，当组合使用AON时，在mRNA水平下观察到的APP695的丰度在蛋白质水平下也是明显的。这些数据清楚地表明，使用AON在体外恢复APP695的水平是可行的，并且因此人们可能对将本文所描述的策略作为如阿尔茨海默病等神经退行性病症的治疗方法的实施方案持乐观态度。在第二方面，提供了根据第一方面所述的反义寡核苷酸(AON)，所述AON在疗法或诊断中使用。在第三方面，提供了根据第一方面所述的反义寡核苷酸(AON)，所述AON用于治疗、预防或改善神经退行性病症。在第四方面，提供了一种治疗、改善或预防受试者的神经退行性病症的方法，所述方法包括向需要这种治疗的受试者施用治疗有效量的根据第一方面所述的反义寡核苷酸(AON)。优选地，所述神经退行性病症是阿尔兹海默病。如本文所描述的，专利技术人已经开发出有效的策略，所述策略修饰APP剪接变体的比率，而不是总体上减少表达量。如此，所述策略基于允许APP的表达并增加APP695同种型(缺少外显子7和8)的相对浓度，同时通过跳读在已知存在的任何APP前mRNA同种型中的外显子7和/或8来减少APP751同种型(缺少外显子7但包含外显子8)和APP770同种型(包含外显子7和8两者)的量。用于改变基因表达和具体蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种反义寡核苷酸(AON)，其能够减少或防止外显子7和/或外显子8包含到通过从淀粉样前体蛋白(APP)转录物剪接而产生的APP mRNA中。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180226 GB 1803010.61.一种反义寡核苷酸(AON)，其能够减少或防止外显子7和/或外显子8包含到通过从淀粉样前体蛋白(APP)转录物剪接而产生的APPmRNA中。


2.根据权利要求1所述的AON，其中所述AON促进外显子跳读，以增加APP695mRNA同种型的表达，并减少APP751同种型和APP770同种型的量。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的AON，其中所述AON能够减少或防止外显子7包含到通过从淀粉样前体蛋白(APP)转录物剪接而产生的APPmRNA中。


4.根据前述权利要求中任一项所述的AON，其中所述AON能够减少或防止外显子8包含到通过从淀粉样前体蛋白(APP)转录物剪接而产生的APPmRNA中。


5.根据前述权利要求中任一项所述的AON，其中通过跳读外显子7和8制备的蛋白质包括以下特征：
1)外显子6与外显子9接合，从而维持读框并产生具有695个氨基酸的蛋白质，所述蛋白质在本文中被称为“APP695”；
2)外显子7内的库尼茨(Kunitz)型蛋白酶抑制剂结构域(KPI)被去除；和/或
3)外显子8内的与胸腺源性淋巴细胞的OX-2抗原共享同源性的结构域被去除。


6.根据前述权利要求中任一项所述的AON，其中所述AON能够与以下内的靶区域结合和/或互补：-
(i)APP基因的内含子6-7的3'部分和/或外显子7的5'部分；
(ii)所述APP基因的外显子7；
(iii)所述APP基因的外显子7的3'部分和/或内含子7-8的5'部分；
(iv)所述APP基因的内含子7-8的3'部分和/或外显子8的5'部分；
(v)所述APP基因的外显子8；和/或
(vi)所述APP基因的外显子8'的3'部分和/或内含子8-9的5'部分。


7.根据权利要求6所述的AON，其中所述AON与其互补靶区域具有至多4个或更少错配、或3个或更少、或2个或更少、或1个或没有错配。


8.根据权利要求6或权利要求7所述的AON，其中所述AON与所述靶区域中的至少8个核苷酸互补，或与所述靶区域中的8到50个核苷酸或12到50个核苷酸互补。


9.根据前述权利要求中任一项所述的AON，其中所述AON的长度为18到42个核苷酸、或22到42个核苷酸或27到39个核苷酸。


10.根据权利要求6到9中任一项所述的AON，其中当所述AON能够减少或防止外显子7包含到通过从APP转录物剪接而产生的APPmRNA中时，用于所述AON的所述靶区域位于内含子6/外显子7接合点上游150个核苷酸(-150)与外显子7/内含子7接合点下游150个核苷酸(+150)之间。


11.根据权利要求10所述的AON，其中所述AON靶区域跨越人APP基因的外显子7上游15个核苷酸和下游150个核苷酸(-15到+50)，并表示为SEQIDNO:5。


12.根据权利要求10或权利要求11所述的AON，所述AON与外显子7内或邻近于所述外显子的靶区域互补，并且包括选自由SEQIDNO:6、7、8、9和10组成的组的核苷酸序列。


13.根据权利要求12所述的AON，其中所述AON包括SEQIDNO:7的核苷酸序列。


14.根据权利要求6到9中任一项所述的AON，其中当所述AON能够减少或防止外显子8包含到通过从APP转录物剪接而产生的APPmRNA中时，用于所述AON的所述靶区域位于内含子7/外显子8接合点上游150个核苷酸(-150)与外显子8/内含子8接合点下游150个核苷酸(+150)之间。


15.根据权利要求14所述的AON，其中所述AON靶区域跨越人APP基因的外显子8上游核苷酸50个核苷酸和下游50个核苷酸(-50到+50)，并表示为SEQIDNO:11。


16.根据权利要求14或权利要求15所述的AON，其中所述AON与外显子8内或邻近于所述外显子的靶区域互补，并且包括选自由SEQIDNO:12、13、14和15组成的组的核苷酸序列。


17.根据权利要求16所述的AON，其中所述AON包括SEQIDNO:13的核苷酸序列。


18.根据前述权利要求中任一项所述的AON，其中所述AON是寡核糖核苷酸。

【专利技术属性】
技术研发人员：P·阿里弗拉吉斯，L·波普韦尔，G·迪生，A·圣嘉，
申请(专利权)人：皇家霍洛威和贝德福德新学院，
类型：发明
国别省市：英国;GB