逃避中和的肝趋向性重组AAV6载体制造技术

如本文所证明，提供了修饰的重组AAV6载体，该修饰的重组AAV6载体转导肝并且具有降低的ADK6抗体对肝转导的中和。因此，本发明专利技术的实施方式涉及逃避中和的肝趋向性rAAV6载体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】逃避中和的肝趋向性重组AAV6载体相关申请的交叉引用根据35U.S.C.§119(e)，本国际申请要求2018年3月29日提交的美国临时申请号62/649,691的优先权，以引用的方式将其内容整体并入本文。序列表本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式电子提交并且以引用的方式将其整体并入本文。所述ASCII副本创建于2019年3月25日，命名为046192-091920WOPT_SL.txt，并且大小为8,294字节。
本专利技术的实施方式涉及逃避中和的肝趋向性(livertropic)rAAV6载体。
技术介绍
腺相关病毒(AAV)是非致病性依赖细小病毒，被用作基因治疗的载体。已鉴定出多种血清型和变体，其中数种已用于临床试验。尽管在临床试验中已经获得了AAV载体的治疗效果，但AAV载体的主要挑战之一在于需要治疗先前未暴露于该病毒的那些初始受试者以及由于免疫应答而无法重新给予该载体。因此，本领域中存在开发可以逃避免疫应答并且可以在特定组织中有效递送和表达基因的基因治疗载体的需求。
技术实现思路
在本专利技术的一个方面，提供了一种修饰的重组AAV6载体，所述修饰的重组AAV6载体在选自于由以下氨基酸残基所组成的组中的一个或多个氨基酸残基处包含置换：对应于AAV6VP1编号的S264、G266、N269、H272、Q457、S588和T589，其中，与缺乏一个或多个置换的rAAV6载体相比，所述rAAV6载体转导肝并且具有降低的ADK6抗体对肝转导的中和。在一个实施方式中，修饰的AAV6载体还在氨基酸531(AAV6VP1编号)处包含赖氨酸(K)。在一个实施方式中，修饰的AAV6载体在对应于AAV6VP1编号的氨基酸531处包含精氨酸(R)。在某些在氨基酸531处存在K或R的实施方式中，所述一个或多个氨基酸中的至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或至少七个被置换。在上述的某些实施方式中，所述一个或多个置换包括保守氨基酸置换。在某些实施方式中，所述一个或多个置换包括非保守置换。在本文描述的一个实施方式中，修饰的rAAV6载体进一步包含选自于由以下氨基酸所组成的组中的氨基酸的一个或多个修饰区域：对应于AAV6VP1编号的262-272、382-386、445-457、459、469-473、488-489、494-496、499-515、571-579、584-589和593-595，其中，所述一个或多个修饰区域中的至少一个或多个氨基酸被置换。SEQIDNO：1示出了AAV6VP1。因此，对应于AAV6VP1的S264、G266、N269、I-1272、Q457、S588、T589和K531或R531分别为SEQIDNO：1的S264、G266、N269、H272、Q457、S588、T489、K531和R531。在另一方面，提供了一种修饰的rAAV6载体，所述修饰的rAAV6载体包含选自于由以下氨基酸所组成的组中的氨基酸的一个或多个修饰区域：262-272、382-386、445-457、459、469-473、488-489、494-496、499-515、571-579、584-589和593-595(对应于AAV6VP1编号)，其中，所述一个或多个修饰区域中的至少一个或多个氨基酸被置换，并且其中，与缺乏一个或多个置换的rAAV6载体相比，所述rAAV6载体转导肝并且具有降低的ADK6抗体对肝转导的中和。在另一方面，提供了一种修饰的rAAV6载体，所述修饰的rAAV6载体包含选自于由以下氨基酸所组成的组中的氨基酸的一个或多个修饰区域：269-272、445-450、469-471、493、501-515、584-587(对应于AAV6VP1编号)，其中，所述一个或多个修饰区域中的至少一个或多个氨基酸被置换，并且其中，与缺乏一个或多个置换的rAAV6载体相比，所述rAAV6载体转导肝并且具有降低的ADK6抗体对肝转导的中和。在一些实施方式中，在本文所述的任何方面，修饰的rAAV6载体包含K531或R531。在本文描述的各个方面的一些实施方式中，修饰的rAAV6载体进一步包含选自于由以下氨基酸所组成的组中的结合唾液酸的一个或多个氨基酸的置换：N447、S472、V473、N500、T502和W503。在一些实施方式中，在本文所述的各个方面，修饰的rAAV6载体在选自于由以下氨基酸区域所组成的组中的一个或多个氨基酸区域处包含氨基酸置换：456-459、492-499和588-597。在一些实施方式中，在本文所述的各个方面，修饰的rAAV6载体包含选自于由以下氨基酸序列所组成的组中的一个或多个氨基酸序列：456-499处的SEER(SEQIDNO：2)、492-499处的TPGGNATR(SEQIDNO：3)、588-597处的DLDPKATEVE(SEQIDNO：4)。在一些实施方式中，在本文所述的各个方面，与未修饰的rAAV6载体的中和相比，修饰的rAAV6载体具有降低的针对未修饰的rAAV6的人抗血清对肝转导的中和。在一些实施方式中，在本文所述的各个方面，与未修饰的rAAV6载体的中和相比，修饰的rAAV6载体具有降低的针对未修饰的rAAV6的小鼠抗血清对肝转导的中和。在一些实施方式中，在本文所述的各个方面，与未修饰的rAAV6载体的中和相比，修饰的rAAV6载体具有降低的针对未修饰的rAAV6的恒河猴(rhesusmacaques)抗血清对肝转导的中和。在另一方面，提供了一种用于分离AAV6病毒粒子的方法，所述病毒粒子保留了肝趋向性(tropism)并且具有降低的ADK6抗体引起的中和。该方法包括：产生饱和诱变AAV6文库，其中，选自于由S264、G266、N269、H272、Q457、S588和T589所组成的组中的各个氨基酸被20种不同的天然或非天然氨基酸中的每一种在全部位置或少于全部位置的任意组合处置换；通过用rAAV6文库感染肝的细胞(例如肝细胞)或组织来进行多轮进化(roundsofevolution)；以及筛选ADK6或野生型rAAV6抗血清引起的中和的降低。在上述的一个实施方式中，文库的rAAV6包含K531或R531。在一个实施方式中，该方法进一步包括筛选唾液酸结合的丧失(例如通过柱色谱法)。在一个实施方式中，该方法进一步包括筛选唾液酸结合的存在(例如通过柱色谱法)。在另一方面，提供了一种用于鉴别AAV6病毒粒子的方法，所述病毒粒子保留了肝趋向性并且表现出降低的AAV6中和抗体(诸如ADK6抗体)引起的中和。该方法包括：产生选自于由以下氨基酸所组成的组中的氨基酸的一个或多个修饰区域的饱和诱变文库：262-272、382-386、445-457、459、469-473、488-489、494-496、499-515、571-579、584-589和593-595，其中，一个或多个区域被20种不同的天然或非天然氨基酸中的每一种在全部位置或少于全部位置的任意组合处置换；通过用rAAV6文库感染本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种修饰的重组AAV6载体，所述修饰的重组AAV6载体在选自于由以下氨基酸残基所组成的组中的一个或多个氨基酸残基处包含氨基酸置换：对应于AAV6 VP1编号的S264、G266、N269、H272、Q457、S588和T589，其中，与缺乏一个或多个置换的rAAV6载体相比，所述rAAV6载体转导肝并且具有降低的ADK6抗体对肝转导的中和。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180329 US 62/649,6911.一种修饰的重组AAV6载体，所述修饰的重组AAV6载体在选自于由以下氨基酸残基所组成的组中的一个或多个氨基酸残基处包含氨基酸置换：对应于AAV6VP1编号的S264、G266、N269、H272、Q457、S588和T589，其中，与缺乏一个或多个置换的rAAV6载体相比，所述rAAV6载体转导肝并且具有降低的ADK6抗体对肝转导的中和。


2.如权利要求1所述的修饰的AAV6载体，所述修饰的AAV6载体在对应于AAV6VP1的氨基酸531的氨基酸位点处进一步包含赖氨酸(K)或精氨酸(R)。


3.如权利要求2所述的修饰的AAV6载体，所述修饰的AAV6载体在氨基酸531处包含K。


4.如权利要求2所述的修饰的AAV6载体，所述修饰的AAV6载体在氨基酸531处包含R。


5.如权利要求1-3中任一项所述的修饰的AAV6载体，其中，所述一个或多个氨基酸中的至少两个被置换。


6.如权利要求1-4中任一项所述的修饰的AAV6载体，其中，所述一个或多个氨基酸中的至少三个被置换。


7.如权利要求1-5中任一项所述的修饰的AAV6载体，其中，所述一个或多个氨基酸中的至少四个被置换。


8.如权利要求1-6中任一项所述的修饰的AAV6载体，其中，所述一个或多个氨基酸中的至少五个被置换。


9.如权利要求1-7中任一项所述的修饰的AAV6载体，其中，所述一个或多个氨基酸中的至少六个被置换。


10.如权利要求1-8中任一项所述的修饰的AAV6载体，其中，所述一个或多个氨基酸中的至少七个被置换。


11.如权利要求1-9中任一项所述的修饰的AAV6载体，其中，所述一个或多个置换包括保守置换。


12.如权利要求1-9中任一项所述的修饰的AAV6载体，其中，所述一个或多个置换包括非保守置换。


13.如权利要求1-11中任一项所述的修饰的rAAV6载体，所述修饰的rAAV6载体进一步包含选自于由以下氨基酸所组成的组中的结合唾液酸的至少一个氨基酸的置换：对应于AAV6VP1编号的N447、S472、V473、N500、T502和W503。


14.如权利要求1-12中任一项所述的修饰的rAAV6载体，所述修饰的rAAV6载体进一步包含选自于由以下氨基酸所组成的组中的氨基酸的一个或多个修饰区域：对应于AAV6VP1编号的262-272、382-386、445-457、459、469-473、488-489、494-496、499-515、571-579、584-589和593-595，其中，所述一个或多个修饰区域中的至少一个或多个氨基酸被置换。


15.一种修饰的重组AAV6载体，所述修饰的重组AAV6载体在选自于由以下氨基酸残基所组成的组中的一个或多个氨基酸残基处包含置换：对应于AAV6VP1编号的S264、G266、N269、H272、Q457、S588和T589，其中，与缺乏一个或多个置换的rAAV6载体相比，所述rAAV6载体转导肝并且具有降低的ADK6抗体对转导的中和。


16.一种修饰的rAAV6载体，所述修饰的rAAV6载体包含选自于由以下氨基酸所组成的组中的氨基酸的一个或多个修饰区域：对应于AAV6VP1编号的262-272、382-386、445-457、459、469-473、488-489、494-496、499-515、571-579、584-589和593-595，其中，所述一个或多个修饰区域中的至少一个或多个氨基酸被置换，并且其中，与缺乏一个或多个置换的rAAV6载体相比，所述rAAV6载体转导肝并且具有降低的ADK6抗体对肝转导的中和。


17.如权利要求15所述的修饰的rAAV6载体，所述修饰的rAAV6载体包含对应于AAV6VP1编号的K531。


18.如权利要求15所述的修饰的rAAV6载体，所述修饰的rAAV6载体包含对应于AAV6VP1编号的R531。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·裘德·萨穆尔斯基，梅维斯·阿格班德基麦肯纳，安东内特·班尼特，
申请(专利权)人：阿斯克肋匹奥生物制药公司，佛罗里达大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：美国;US