一种微波同步提取并测定牧草中多种脂溶性维生素的方法技术

本发明专利技术公开了一种微波同步提取并测定牧草中多种脂溶性维生素的方法，该方法以微波消解技术作为提取手段，以异丙醇与正己烷为提取试剂，采用硅胶与中性氧化铝作为净化材料，以高效液相色谱‑串联质谱仪对维生素A、a‑生育酚、r‑生育酚、δ‑生育酚、维生素D2、维生素D3、维生素K1、维生素K3进行定性与定量。本发明专利技术的微波同步提取并测定牧草中多种脂溶性维生素的方法提出维生素微波提取技术，在提取方法上实现了突破，做到同步提取8种脂溶性维生素，并利用液相色谱串联质谱仪进行定性与定量分析，建立了高效液相色谱串联质谱法的多参数技术指标，提取效率高、特异性强和灵敏度高，检测结果准确性可靠，适用于批量样品的快速检测。

【技术实现步骤摘要】
一种微波同步提取并测定牧草中多种脂溶性维生素的方法
本专利技术涉及牧草中维生素的提取检测
，具体来说，涉及一种微波同步提取并测定牧草中多种脂溶性维生素的方法。
技术介绍
维生素是维持人体和动物体正常生理功能所必需的一类活性物质，在机体生长发育、新陈代谢、抗氧化等方面发挥重要作用，但机体无法自身合成，需通过外界摄入。牧草是畜牧业发展的保障基础，营养品质备受关注。苜蓿、多年生黑麦草、菊苣、燕麦、羊草、披碱草等牧草中含有多种维生素；目前关于牧草中脂溶性维生素的检测方法报道不多，现有标准或文献报道中涉及饲草料脂溶性维生素的检测方法只能同时提取一种或某几种特定的指标，目标物定量与定性大多依靠色谱完成，无法实现多种维生素同步提取测定，检测分析效率较低；例如《饲料中维生素A的测定高效液相色谱法》(GB/T17817-2010)，《饲料中维生素D3的测定高效液相色谱法》(GB/T17818-2010)，《饲料中维生素E的测定高效液相色谱法》(GB/T17812-2008)，《饲料中维生素A、维生素D3、维生素E的同步快速测定高效液相色谱法》(DB37/T3674-2019)，上述方法只是针对一种维生素或某几种结构和性质相似的维生素的提取和检测，而提取大多需经过皂化过程，皂化时需引入石油醚和乙醚等高毒性、易燃试剂，易造成安全隐患；检测时需要依靠液相色谱法进行定性与定量分析，极易受到基质效应的影响，定性准确性存在局限性，检测效率较低。
技术实现思路
针对相关技术中的上述技术问题，本专利技术提出一种微波同步提取并测定牧草中多种脂溶性维生素的方法，能够克服现有技术的上述不足。为实现上述技术目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：一种微波同步提取并测定牧草中多种脂溶性维生素的方法，该方法以微波消解技术作为提取手段，以异丙醇与正己烷为提取试剂，采用硅胶与中性氧化铝作为净化材料，以高效液相色谱-串联质谱仪对维生素A、a-生育酚、r-生育酚、δ-生育酚、维生素D2、维生素D3、维生素K1、维生素K3进行定性与定量，具体包括以下步骤：(1)样品预处理：采用液氮将待测样品进行研磨，得到粒径为80-100目的待测样品；(2)提取过程：准确称取1g样品于微波消解管，加入1g抗坏血酸，加入10-30mL正己烷与异丙醇的混合液，涡旋3-5min，于微波消解仪内在50-80℃下消解10-30min，消解结束后静置，待溶液澄清后移取上清液5mL，用硅胶和中性氧化铝净化，氮吹至净干，用甲醇定容至1mL，过膜上机；(3)LC-MSMS分析：以高效液相色谱-串联质谱仪对试样中的8种脂溶性维生素进行定性、定量检测，所述8种脂溶性维生素为维生素A、a-生育酚、r-生育酚、δ-生育酚、维生素D2、维生素D3、维生素K1、维生素K3；(4)结果计算：试样中待测组分的测定结果计算公式为：式中：X为试样中待测组分含量，c为从标准曲线得到的试样中待测组分的浓度，V为试样溶液定容体积，V1为试样溶液提取体积，V2为试样溶液分取体积，m为试样的质量。进一步地，色谱条件为：色谱柱规格：C18柱，100mm×2.1mm，粒径1.7μm；流动相以一级水和甲醇，采用梯度洗脱；质谱扫描方式采用正离子多反应监测模式，电离电压为2500V，离子源温度为120℃，雾化温度为450℃，雾化器流速为650L/h。进一步地，目标物确定的方法为：在相同实验条件下进行样品测定时，样品中待测物质的色谱峰保留时间与标准品色谱峰保留时间相差在±2.5％以内，且样品色谱图中定性离子的相对离子丰度与浓度相近的标准工作液色谱图中对应的定性离子相对丰度进行比较，根据相对偏差判定样品中是否存在所述待测物质。进一步地，回收率和精密度的测定方法为：分别添加浓度为0.1μg/mL、1μg/mL的所述8种脂溶性维生素得到回收率结果；分别重复三次实验，计算相对标准偏差，在重复条件下，获得两次独立测定结果的绝对差值与平均值的比，计算相对偏差，得到结果的精密度。进一步地，采用外标法定量，将所述8种脂溶性维生素的系列标准工作液分别注入液相色谱串联质谱仪，测定相应峰面积，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程，R2均大于0.99，检出限为3倍信噪比，定量限为10倍信噪比。进一步地，所述混合液中异丙醇与正己烷的体积比为1:1-3:1；所述混合液的体积为30mL。进一步地，微波消解仪以5min升温至80℃，保持20min。进一步地，硅胶与中性氧化铝的总用量为1g,硅胶与中性氧化铝的质量比为1:1-2:1。本专利技术的有益效果：本专利技术首次建立了微波消解同步提取牧草中8种脂溶性维生素的提取和超高效液相色谱-串联质谱测定的多项参数技术指标，在80℃下消解30min可完成提取过程，采用超高效液相色谱串联质谱仪对目标物的定量与定性10min即可完成，与传统方法相比，简化了提取工艺、拓展了检测能力，检测效率显著提高；可完成8种脂溶性维生素的同步提取，检测效率提高2-3倍，灵敏度和定性准确性显著提高；采用异丙醇和正己烷进行样品提取，很好替代了传统以石油醚和无水乙醚等受控、高毒性、易燃的提取剂。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是根据本专利技术实施例所述的异丙醇与正己烷体积比分别为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3时的回收率。图2是根据本专利技术实施例所述的提取溶剂体积分别为10mL、20mL、30mL、40mL、50mL时的回收率。图3是根据本专利技术实施例所述的消解温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃、100℃时的回收率。图4是根据本专利技术实施例所述的中性氧化铝与硅胶质量比分别为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3时的回收率。图5是根据本专利技术实施例所述的标准品的质谱图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1(1)样品预处理：采用液氮将待测样品进行研磨，得到粒径为80-100目的待测样品。(2)提取过程：准确称取约1g样品(精确至0.01g)于微波消解管，加入1g抗坏血酸，加入正己烷与异丙醇混合液，涡旋一定时间，于微波消解仪内消解，消解结束后静置，待溶液澄清后移取上清液5mL，用硅胶和中性氧化铝净化(硅胶和中性氧化铝总用量为1g，需先用正己烷活化，上样净化、乙酸乙酯与正己烷洗脱(9:1))，氮吹至净干，甲醇定容至1mL，过膜上机。分别对提取溶剂正己烷与异丙醇体积比、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微波同步提取并测定牧草中多种脂溶性维生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）样品预处理：采用液氮将待测样品进行研磨，得到粒径为80-100目的待测样品；/n（2）提取过程：准确称取1g样品于微波消解管，加入1g抗坏血酸，加入10-30mL正己烷与异丙醇的混合液，涡旋3-5min，于微波消解仪内在50-80℃下消解10-30min，消解结束后静置，待溶液澄清后移取上清液5mL，用硅胶和中性氧化铝净化，氮吹至净干，用甲醇定容至1mL，过膜上机；/n（3）LC-MSMS分析：以高效液相色谱-串联质谱仪对试样中的8种脂溶性维生素进行定性、定量检测，所述8种脂溶性维生素为维生素A、a-生育酚、r-生育酚、δ-生育酚、维生素D2、维生素D3、维生素K1、维生素K3；/n（4）结果计算：试样中待测组分的测定结果计算公式为：/n

【技术特征摘要】
1.一种微波同步提取并测定牧草中多种脂溶性维生素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品预处理：采用液氮将待测样品进行研磨，得到粒径为80-100目的待测样品；
（2）提取过程：准确称取1g样品于微波消解管，加入1g抗坏血酸，加入10-30mL正己烷与异丙醇的混合液，涡旋3-5min，于微波消解仪内在50-80℃下消解10-30min，消解结束后静置，待溶液澄清后移取上清液5mL，用硅胶和中性氧化铝净化，氮吹至净干，用甲醇定容至1mL，过膜上机；
（3）LC-MSMS分析：以高效液相色谱-串联质谱仪对试样中的8种脂溶性维生素进行定性、定量检测，所述8种脂溶性维生素为维生素A、a-生育酚、r-生育酚、δ-生育酚、维生素D2、维生素D3、维生素K1、维生素K3；
（4）结果计算：试样中待测组分的测定结果计算公式为：



式中：
X为试样中待测组分含量，
c为从标准曲线得到的试样中待测组分的浓度，
V为试样溶液定容体积，
V1为试样溶液提取体积，
V2为试样溶液分取体积，
m为试样的质量。


2.根据权利要求1所述的微波同步提取并测定牧草中多种脂溶性维生素的方法，其特征在于，色谱条件为：色谱柱规格：C18柱，100mm×2.1mm，粒径1.7µm；流动相以一级水和甲醇，采用梯度洗脱；质谱扫描方式采用正离子多反应监测模式，电离电压为2500V，离子源温度为120℃，雾化温度为450℃，雾化器流速为650L/h。


3.根据权利要求1所述的微波同步提取并测定牧草中多种脂溶性维生素的方法，其特征在于，目标物确定的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘广华，张福金，杨永青，张欣昕，莎娜，狄彩霞，李国银，
申请(专利权)人：内蒙古自治区农牧业科学院，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15