用于子痫前期临床风险评估的长链非编码RNA及其应用制造技术

用于子痫前期临床风险评估的长链非编码RNA，包括：查阅并分析患者病历资料，收集正常孕妇及子痫前期孕妇胎盘组织；制备胎盘组织石蜡切片，胎盘组织马松染色观察胎盘组织结构改变；生物信息学分析损伤诱导的非编码RNA的结构；提取胎盘组织长链非编码RNA，并检测损伤诱导的非编码RNA表达改变；培养人源胎盘滋养细胞，筛选损伤诱导的非编码RNA干扰片段；干扰损伤诱导的非编码RNA后，检测基质金属蛋白酶2(MMP‑2)蛋白表达改变；干扰损伤诱导的非编码RNA后，划痕试验检测细胞迁移能力及侵袭实验检测细胞侵袭改变。本发明专利技术用于子痫前期预防及诊断。本发明专利技术样本获取简单便捷，不会造成患者任何创伤，具有较强的可行性。

【技术实现步骤摘要】
用于子痫前期临床风险评估的长链非编码RNA及其应用
本专利技术属于医学
，是涉及用于子痫前期临床风险评估的长链非编码RNA及其应用。
技术介绍
子痫前期(preeclampsia，PE)是造成孕产妇多器官、多系统损伤的一种常见的妊娠期并发症，属于妊娠期特发疾病中的一种，常以妊娠20周后出现高血压、蛋白尿为主要临床表现，严重时可产生全身系统功能障碍，是孕产妇妊娠期及围生儿死亡的重要原因。血液、尿液、眼底检查等是子痫前期现阶常用诊断方法，但此类方法传统，主要还是依靠特征性对的疾病临床表现进行诊断，但通常诊断明确时，孕周通常较大。在治疗方面，目前也只能对症治疗缓解症状，由于孕妇用药的特殊性，少有既能保障安全又能确保疗效的药物；在有效治疗方案缺乏的情况下，终止妊娠是彻底治愈的唯一措施，而娩出的未足月儿及低出生体重儿将为家庭带来沉重的经济负担。基于此，寻找一种用于子痫前期临床风险评估的分子诊断标志物，探讨子痫前期的防治策略，全面响应国家“优生优育”政策，这对提高人类生殖健康水平、优化出生人口素质具有长足且深远的意义。子痫前期的病因可能涉及多种因素，包括异常的滋养细胞浸润、免疫调节功能障碍、遗传因素、胰岛素抵抗和营养不良等。目前较普遍认为滋养细胞浸润过浅所致的子宫螺旋动脉重塑障碍、胎盘浅着床是子痫前期发生发展的主要原因。子痫前期的发展主要分为两个阶段，妊娠早期阶段：胎盘在形成时期血液灌注不足、免疫耐受等多因素作用下，使滋养细胞侵袭不足，螺旋动脉重铸障碍，造成胎盘供血供氧不足；妊娠晚期阶段：由于氧化应激、炎症反应等导致胎盘合成并释放大量因子，引起母体血管内皮功能紊乱，各器官内皮细胞功能障碍，全身小血管痉挛，进而引起各种临床症状。胎盘作为妊娠期特有的重要临时性器官，承载着母体营养传输和母胎屏障等重要功能，也是妊娠期母胎之间适应性调节的重要纽带，其发育的异常是子痫前期等不良妊娠结局发生的关键。而滋养细胞作为胎盘组织的重要功能细胞，在正常妊娠时原始细胞滋养细胞逐渐分化为绒毛外滋养细胞，该细胞进行增殖和侵袭促进螺旋动脉重塑，其通过类似肿瘤细胞的浸润能力，穿透母胎界面，促使胎盘形成，从而维持正常的胎盘功能。因此，绒毛外滋养细胞的增殖和侵袭能力对胎盘的发育至关重要。长链非编码RNA（longnoncodingRNA，lncRNA）是一类内源性的、长度大于200个核苷酸的RNA分子，位于细胞质或者细胞核中，由于缺乏显著开放阅读框（ORF）而不具有编码蛋白质功能，近年来随着高通量测序和生物信息学技术的发展，检测发现越来越多的长链非编码RNA能够通过对染色质重塑、mRNA降解和翻译抑制等过程进行调控而影响疾病的发生。有文献报道，长链非编码RNA在子痫前期的发生发展中表现出不同的表达模式，发挥不同的作用，可以影响滋养细胞的增殖，迁移，侵袭和凋亡等，进而影响子痫前期的发生发展。损伤诱导的非编码RNA(DamageInducedNoncoding，DINO)是长链非编码RNA分子中的一员，其可促进DNA损伤，影响细胞凋亡等生物学进程，其存在通过调控细胞侵袭、迁移参与子痫前期发生发展的可能。我们在子痫前期患者胎盘组织中通过RT-qPCR检测子痫前期患者胎盘组织中lncRNADINO（损伤诱导的非编码RNA）表达增加，细胞水平转染lncRNADINO干扰片段，划痕实验及Transwell侵袭实验检测细胞迁移、侵袭能力增强，MMP-2蛋白表达增加，表明lncRNADINO表达增加能够降低滋养细胞迁移及侵袭能力，由此可见，lncRNADINO是影响胎盘滋养细胞侵袭及迁移能力的关键分子，可作为临床早期诊断和病情发展评估提供一类新的标志物，也为临床治疗滋养细胞浸润不足所致的子痫前期提供新的治疗思路，具有潜在的价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于子痫前期临床风险评估的长链非编码RNA及其应用，该长链非编码RNA及作用验证取材分别来自胎盘组织及细胞，获取样本方式及途径相对简单快速，不会造成任何创伤，患者普遍容易接受，具有较强的可行性。其具体技术方案为：用于子痫前期临床风险评估的长链非编码RNA，包括以下步骤：(1)查阅并分析患者病历资料，收集正常孕妇及子痫前期孕妇胎盘组织；(2)制备胎盘组织石蜡切片，胎盘组织马松染色观察胎盘组织结构改变；(3)生物信息学分析损伤诱导的非编码RNA的结构；(4)提取胎盘组织长链非编码RNA，并检测损伤诱导的非编码RNA表达改变；(5)培养人源胎盘滋养细胞，筛选损伤诱导的非编码RNA干扰片段；(6)干扰损伤诱导的非编码RNA后，检测MMP-2（基质金属蛋白酶2）蛋白表达改变；(7)干扰损伤诱导的非编码RNA后，划痕试验检测细胞迁移能力及侵袭实验检测细胞侵袭改变。本专利技术所述特异性子痫前期临床风险评估的长链非编码RNA在子痫前期预防及诊断中的应用。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：1、本专利技术明确长链非编码RNA（lncRNADINO）作为子痫前期预警及诊断的关键分子。2、本专利技术的样本取材来自胎盘组织，样本获取简单便捷，不会造成患者任何创伤，普遍能够能到患者的理解，具有较强的可行性。附图说明图1为妊娠患者临床资料图表；图2为胎盘组织马松染色示意图；图3为生物信息学分析长链非编码RNA的结构及位置示意图；图4为胎盘组织长链非编码RNA的表达示意图；图5为筛选损伤诱导的非编码RNA的干扰片段示意图；图6为干扰损伤诱导的非编码RNA后，MMP-2、mRNA的表达改变示意图；图7为干扰损伤诱导的非编码RNA后，MMP-2蛋白表达改变示意图；图8干扰损伤诱导的非编码RNA后，划痕试验检测细胞迁移能力及侵袭实验检测细胞侵袭改变示意图。图1中，收集的子痫前期患者临床病历资料，包括孕周、身高、体重、BMI、血压、尿蛋白等指标；注：*P<0.05，与正常妊娠组相比。图2中，NC组为正常妊娠组，PE组为子痫前期组。图3中，其中（A）DINO在染色体上的位置；（B）DINO（损伤诱导的非编码RNA）的基因来源及相关信息；（C）DINO的转录本长度。图4中，纵坐标：lncRNADINOexpressionlevels:为lncRNADINO（DNA损伤诱导的非编码RNA）的表达；横坐标：NC表示正常妊娠组，PE表示子痫前期组；注：*P<0.01，与正常妊娠组相比。图5中，纵坐标：lncRNADINOexpressionlevels:为DNA损伤诱导的非编码RNA的表达；横坐标：0表示正常细胞组，si-NC表示转染阴性对照干扰片段细胞组，si-DINO表示转染DNA损伤诱导的非编码RNA干扰片段细胞组；注：*P<0.05，与空白对照组相比。图6中，纵坐标：MMP-2（基质金属蛋白酶2）mRNA（信使单链核糖核酸）expressionlevel表示基质金属蛋白酶2的信使单链核糖核酸表达水平；横坐标：si-NC表示转染阴性本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于子痫前期临床风险评估的长链非编码RNA，其特征在于，包括以下步骤：/n(1) 查阅并分析患者病历资料，收集正常孕妇及子痫前期孕妇胎盘组织；/n(2) 制备胎盘组织石蜡切片，胎盘组织马松染色观察胎盘组织结构改变；/n(3) 生物信息学分析损伤诱导的非编码RNA的结构；/n(4) 提取胎盘组织长链非编码RNA，并检测损伤诱导的非编码RNA表达改变；/n(5) 培养人源胎盘滋养细胞，筛选损伤诱导的非编码RNA干扰片段；/n(6) 干扰损伤诱导的非编码RNA后，检测MMP-2（基质金属蛋白酶2）蛋白表达改变；/n（7）干扰损伤诱导的非编码RNA后，划痕试验检测细胞迁移能力及侵袭实验检测细胞侵袭改变。/n

【技术特征摘要】
1.用于子痫前期临床风险评估的长链非编码RNA，其特征在于，包括以下步骤：
(1)查阅并分析患者病历资料，收集正常孕妇及子痫前期孕妇胎盘组织；
(2)制备胎盘组织石蜡切片，胎盘组织马松染色观察胎盘组织结构改变；
(3)生物信息学分析损伤诱导的非编码RNA的结构；
(4)提取胎盘组织长链非编码RNA，并检测损伤诱导的非编码RNA表达改变；
(5)培养人源胎盘滋养细胞，筛选损伤诱导的非编码RNA干扰片段；
(6)干扰损伤诱导的非编码RNA后，检测MMP-2（基质金属蛋白酶2）蛋白表达改变；
（7）干扰损伤诱导的非编码RNA后，划痕试验检测细胞迁移能力及侵袭实验检测细胞侵袭改变。


2.根据权利要求1所述的用于子痫前期临床风险评估的长链非编码RNA，其特征在于，所述的胎盘组织马松染色的操作方法为：胎盘组织切片恢复室温，分别浸入二甲苯Ⅰ15min、二甲苯Ⅱ5min，梯度酒精脱水100%、100%、95%、85%、75%，每次3min，蒸馏水洗3次，每次2min；Bouin液煤染，56℃烤箱，片盒中加水，避免干片，孵育1h；铁苏木素液染核20min，流水冲洗5min；丽春红酸性复红染液10min；蒸馏水洗3次，每次2min，1%磷钼酸染色7min，不经水洗，直接加苯胺蓝染色15min；1%冰醋酸水溶液浸洗1min，流水冲洗自来水；95%酒精、100%酒精、100%酒精、二甲苯透明、中性树胶封固，普通显微镜观察胎盘组织结构改变。


3.根据权利要求1所述的用于子痫前期临床风险评估的长链非编码RNA，其特征在于，所述的检测MMP-2（基质金属蛋白酶2）蛋白表达改变的具体操作为：取胎盘组织和人绒毛膜滋养层细胞、苯甲基磺酰氟与乙基苯基聚乙二醇裂解液，按1:100配制蛋白裂解液，依据细胞量加入裂解液，置于4℃摇床30min，12000rpm、4℃离心20min后，转移蛋白上清液至新的EP管中，按照蛋白与缓冲液4:1的比例，加入上样缓冲，并99℃煮沸变性5min。每孔300μg蛋白样品，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，将胶转印至0.22μm聚偏氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2h，PBST洗膜10min，共3次，加入β-actinβ-肌动蛋白抗体（1:10000）、MMP-2抗体（1:2000）4℃过夜，再PBST室温洗膜10min，重复3次，用辣根过氧化物酶标记的二抗（1:5000）室温孵育2h后，PBST室温洗膜10min，重复3次，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张慧萍，姜怡邓，张辉，刘圆，马芳，马胜超，杨安宁，
申请(专利权)人：宁夏医科大学总医院，宁夏医科大学，
类型：发明
国别省市：宁夏;64