本发明专利技术公开了一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程领域。本发明专利技术将来源于Bacillus stearothermophilus NO2的环糊精葡萄糖基转移酶进行突变，得到了歧化水解比以及歧化反应催化效率提高的突变体；突变体L277M的歧化活力与水解活力的比值与野生型相比，比野生酶提高了142.98％，突变体L277M的歧化反应催化效率是野生酶的1.71倍。采用本发明专利技术所构建的突变体能够降低生产成本，适于工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用
本专利技术涉及一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程领域。
技术介绍
环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase，EC2.4.1.19)属于α-淀粉酶家族(糖苷水解酶13_2，GH13_2)，能够以淀粉、麦芽糊精等为底物催化转糖苷反应以及水解反应。其中，转糖苷反应包括歧化反应、环化反应及偶合反应。歧化反应是两个不同分子间发生的转糖苷反应，环化反应是分子内发生的转糖苷反应，偶合反应是环化反应的逆反应。在实际应用中，常利用CGTase歧化反应生成多种水溶性、稳定性提高的糖苷化合物，如L-抗坏血酸、橙皮苷、柚皮苷的糖基化产物。然而，已发现的所有天然来源的CGTase均同时具有歧化和水解活性，水解反应作为副反应会降低转糖苷产物的产量。因此，在工业生产中CGTase的水解活性应该尽可能的降低。目前，CGTase很难进一步提高其歧化反应效率。大多数的突变体不能同时兼顾提高歧化活力和降低水解活力。歧化水解比或歧化反应效率的提高可以有效的提高产量，是工业生产中需要解决的一大难题。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术通过对来源于BacillusstearothermophilusNO2的环糊精葡萄糖基转移酶进行改造，以获得歧化水解比或歧化反应催化效率提高的突变体，将突变体应用于工业生产。本专利技术提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，所述突变体为：将出发氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位的由亮氨酸突变为甲硫氨酸，并命名为L277M，氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于BacillusstearothermophilusNO2。本专利技术还提供了一种编码上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因。本专利技术还提供了一种携带上述基因的表达载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述载体为pET系列载体、Duet系列载体、pGEX系列载体、pHY300系列载体、pHY300PLK系列载体、pPIC3K系列载体或pPIC9K系列载体。在本专利技术的一种实施方式中，所述pET系列载体包括pET-15或pET-19或pET-20或pET-24或pET-28或pET-32，所述Duet系列载体包括pRSFDuet-1或pACYCDuet-1，所述pGEX系列载体包括pGEX-4T-2或pGEX-6P。本专利技术还提供了一种携带上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体基因或上述表达载体的微生物细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物细胞为细菌或真菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述微生物细胞为重组原核细胞或真核细胞；所述原核细胞为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述携带上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体基因或上述表达载体的微生物细胞的构建方法为：将携带编码所述突变体酶的基因的重组表达载体通过电击法或化学转化法转入宿主细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体L277M的歧化活力由4-硝基苯基-α-D-麦芽庚糖-4-6-O-亚乙基和麦芽糖来测定。在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体L277M的水解活力由可溶性淀粉测定。本专利技术还提供了一种上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备方法，所述方法为：将携带上述基因或上述表达载体的微生物细胞接种至发酵培养基中进行发酵，发酵结束后，收集发酵获得的发酵液进行离心，离心结束后，从离心获得的发酵上清液中分离得到环糊精葡萄糖基转移酶突变体。本专利技术还提供了一种提高环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力与水解活力比值或提高环糊精葡萄糖基转移酶催化效率的方法，所述方法为将氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第277位的由亮氨酸突变为甲硫氨酸。本专利技术还提供了一种制备淀粉糖或糖苷化合物的方法，所述方法为将上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体或上述微生物细胞添加至含有淀粉的反应体系中进行反应。本专利技术还提供了上述环糊精葡萄糖基转移酶突变体，或上述基因，或上述表达载体，或上述微生物细胞，或上述制备方法在(a)～(c)至少一方面的应用：(a)水解淀粉或水解麦芽糊精；(b)提高环糊精葡萄糖基转移酶催化效率；(c)提高环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力与水解活力比值。有益效果：本专利技术所得到的突变体L277M具有如下效果：(1)采用本专利技术的方法，得到了歧化活力与水解活力的比值得到提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体L277M，其歧化活力与水解活力的比值与野生型相比，比野生酶提高了142.98％。(2)采用本专利技术的方法，环糊精葡萄糖基转移酶在歧化反应中的催化效率得到了提高，突变体L277M的kcat/Km为1175.30s-1mM-1，与野生酶的kcat/Km为686.07s-1mM-1相比，是野生酶的1.71倍。具体实施方式下述实施例中涉及的培养基和检测方法如下：LB液体培养基：胰蛋白胨10g·L-1，酵母粉5g·L-1，氯化钠10g·L-1。LB固体培养基：胰蛋白胨10g·L-1，酵母粉5g·L-1，氯化钠10g·L-1，琼脂粉20g·L-1。TB发酵培养基：胰蛋白胨12g·L-1，酵母粉24g·L-1，甘油5g·L-1，KH2PO42.31g·L-1，K2HPO4·3H2O16.43g·L-1，甘氨酸7.5g·L-1。环糊精葡萄糖基转移酶歧化活力的测定方法：(1)预热：各取300μL的4mM4-硝基苯基-α-D-麦芽七糖苷-4-6-O-亚乙基(EPS)和80mM麦芽糖(50mM，pH5.5的磷酸缓冲液配制)，50℃保温10min。(2)反应：加入0.1mL适当稀释的酶液，反应10min，加热终止反应，然后加入100μL去离子水及100μLα-葡萄糖苷酶在60℃条件下反应1h。(3)测量：加入100μL1MNa2CO3终止反应并调节pH至8.0左右显色，在401nm下测量样品的吸光度并计算酶活力。酶活定义：一个酶活单位(U)定义为一个单位活性定义为每分钟转化1μmolEPS所需的酶量。环糊精葡萄糖基转移酶水解活力的测定方法预热：取1mL的1％可溶性淀粉(50Mm，pH5.5的磷酸缓冲液配制)和900μL的磷酸缓冲液，50℃保温10min。反应：加入0.1mL适当稀释的酶液，反应10min，加入3mL的DNS(3,5-二硝基水杨酸)终止反应，然后煮沸加热7min显色，放入冰水中冷却。测量：样品定容至15mL，在540nm下测定样品的吸光度并计算酶活力。酶活定义：一个酶活单位(U)定义为一个单位活性定义为每分钟生成1μmol麦芽糖所需的酶量。实施例1：野生型环糊精葡萄糖基转移酶的表达从实验室前期保藏的甘油管中蘸取E.coliBL21(DE3)/pET-20b(+)-cgt(构建方法记载于熊艳军《环糊精葡萄糖基转移酶合成本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。/n
【技术特征摘要】
1.一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。
2.编码权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的表达载体。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述载体为pGEX质粒、pHY300质粒、pPIC3K质粒、pPIC9K质粒、pHY300PLK质粒、pET质粒或Duet质粒。
5.携带权利要求2所述基因或权利要求3或4所述表达载体的微生物细胞。
6.如权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为细菌或真菌细胞。
7.权利要求1所述的环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备方法，其特征在于，将权利要求5或6所述的微生物细胞接种至发酵培养基中进行发酵，发酵结束后，收集发酵获得的发酵液进行离心，离心结束后，从离心...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴敬，王蕾，孔德民，宿玲恰，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。