一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基及其制备方法技术

本发明专利技术公开一种用于培养DF‑1细胞的无血清培养基及其制备方法，所述用于培养DF‑1细胞的无血清培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物、酸碱指示剂和其他添加组分，通过对各种成分具体浓度的限定实现了该培养基能够适用于DF‑1细胞的全悬浮无血清培养。该培养基成分明确，培养的细胞密度高，不含动物血清，有利于下游产品的纯化，提高产品品质，且配制和使用方便，适用于DF‑1细胞全悬浮无血清培养和鸡法氏囊疫苗的规模化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基及其制备方法
本专利技术属于细胞无血清培养基
，具体地说涉及一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基及其制备方法。
技术介绍
DF-1细胞为鸭成纤维细胞系，其作为永生化的传代细胞系广泛用于培养繁殖鸡法氏囊病毒。鸡法氏囊病毒感染是主要引起肉仔鸡的一种病毒性传染病。2015年以来该病在国内广泛流行，对3—5周龄肉鸡的致死率高达40％～100％，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。目前最有效的预防措施为疫苗，制备高效疫苗的关键是获得高滴度的病毒，传统的疫苗制造是用含血清的培养基贴壁培养DF-1细胞后进行接毒培养，此培养方法所得细胞浓度低，病毒滴度较低，需要高倍浓缩才能满足制备疫苗的要求，而且培养工艺繁琐，不能满足疫苗规模化生产需要。随着生物制品质量安全性标准的提高和动物细胞生物反应器高密度培养技术的推广应用，研究和生产全悬浮DF-1细胞培养的鸡法氏囊病毒疫苗具有广泛的应用前景。生物反应器高密度培养工艺中细胞全悬浮培养比贴壁细胞培养更具优势，主要表现在：第一，全悬浮培养可用无血清培养基，降低了生产成本，提高了下游产品的生物安全性；第二，全悬浮培养规模可线性放大，国际上细胞生物反应器全悬浮培养的规模可达20000L/罐，国内已生产和运用的细胞生物反应器全悬浮培养的规模可达3000L/罐。目前还没有商品化的DF-1细胞无血清培养基，并且有关DF-1细胞无血清培养基的研究也尚未见报道。针对上述问题，特提出本专利技术。
技术实现思路
针对现有技术的种种不足，为了解决上述问题，现提出一种低成本、成分明确的适用于DF-1细胞全悬浮培养的无血清培养基及其制备方法。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基，包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物、酸碱指示剂和其他添加组分，其中，所述氨基酸为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；所述维生素为生物素、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、硫胺素和硫辛酸；所述盐类为氯化镁、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和丙酮酸钠；所述脂类为胆固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温和嵌段式聚醚F68；所述微量元素为硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁和亚硒酸钠；所述缓冲剂为碳酸氢钠和羟乙基哌嗪乙磺酸；所述蛋白水解物为大豆水解物和小麦水解物；所述酸碱指示剂为酚红；所述的其他添加组分为葡萄糖、次黄嘌呤和胸苷。优选的，所述氨基酸中各成分的终浓度分别为丙氨酸4～8毫克/升、精氨酸100～200毫克/升、天冬酰胺6～20毫克/升、天冬氨酸9～16毫克/升、胱氨酸15～25毫克/升、半胱氨酸20～35毫克/升、谷氨酸7～15毫克/升、谷氨酰胺200～800毫克/升、甘氨酸10～25毫克/升、组氨酸20～50毫克/升、异亮氨酸30～60毫克/升、亮氨酸50～70毫克/升、赖氨酸100～150毫克/升、甲硫氨酸15～30毫克/升、苯丙氨酸30～50毫克/升、脯氨酸15～30毫克/升、丝氨酸20～40毫克/升、苏氨酸30～60毫克/升、色氨酸15～30毫克/升、酪氨酸40～70毫克/升、缬氨酸40～70毫克/升；所述维生素中各成分的终浓度分别为生物素0.003～0.01毫克/升、叶酸2～5毫克/升、烟酰胺5～10毫克/升、吡哆醇2～5毫克/升、硫胺素2～5毫克/升、硫辛酸0.2～0.5毫克/升；所述盐类中各成分的终浓度分别为氯化镁30～100毫克/升、硫酸镁30～100毫克/升、氯化钙150～200毫克/升、氯化钾300～500毫克/升、氯化钠1000～6000毫克/升、磷酸氢二钠50～100毫克/升、磷酸二氢钠50～100毫克/升、丙酮酸钠60～150毫克/升；所述脂类中各成分的终浓度分别为胆固醇2～5毫克/升、生育酚醋酸酯0.005～0.01毫克/升、豆蔻酸0.005～0.01毫克/升、棕榈酸0.005～0.01毫克/升、棕榈油酸0.005～0.01毫克/升、硬脂酸0.005～0.01毫克/升、吐温801～3.0毫克/升、嵌段式聚醚F6810～2000毫克/升；所述微量元素中各成分的终浓度分别为硫酸铜10～20毫克/升、硝酸铁50～100毫克/升、硫酸亚铁0.1～0.6毫克/升、亚硒酸钠80～150毫克/升；所述缓冲剂中各成分的终浓度分别为碳酸氢钠1000～3700毫克/升、羟乙基哌嗪乙磺酸1000～5000毫克/升；所述酚红的终浓度为5～10毫克/升；所述蛋白水解物中各成分的终浓度分别为大豆水解物2000～4000毫克/升、小麦水解物2000～4000毫克/升；所述其他添加组分中各成分的终浓度分别为葡萄糖2000～6000毫克/升、次黄嘌呤5～10毫克/升、胸苷0.1～0.8毫克/升。优选的，所述氨基酸中各成分的终浓度分别为丙氨酸5.2毫克/升、精氨酸168.1毫克/升、天冬酰胺7.92毫克/升、天冬氨酸9.34毫克/升、胱氨酸20.0毫克/升、半胱氨酸31.1毫克/升、谷氨酸12.5毫克/升、谷氨酰胺699.5毫克/升、甘氨酸19毫克/升、组氨酸36.9毫克/升、异亮氨酸53.7毫克/升、亮氨酸61.5毫克/升、赖氨酸134.4毫克/升、甲硫氨酸23.6毫克/升、苯丙氨酸40.2毫克/升、脯氨酸28.8毫克/升、丝氨酸28.0毫克/升、苏氨酸43.3毫克/升、色氨酸25.5毫克/升、酪氨酸51.7毫克/升、缬氨酸60.1毫克/升；所述维生素中各成分的终浓度分别为生物素0.0039毫克/升、叶酸2.95毫克/升、烟酰胺7.98毫克/升、吡哆醇3.33毫克/升、硫胺素4.08毫克/升、硫辛酸0.37毫克/升；所述盐类中各成分的终浓度分别为氯化镁70.4毫克/升、硫酸镁57.9毫克/升、氯化钙158.9毫克/升、氯化钾423.0毫克/升、氯化钠4908.7毫克/升、磷酸氢二钠69.21毫克/升、磷酸二氢钠90.75毫克/升、丙酮酸钠129.90毫克/升；所述脂类中各成分的终浓度分别为胆固醇2.91毫克/升、生育酚醋酸酯0.0072毫克/升、豆蔻酸0.0058毫克/升、棕榈酸0.0065毫克/升、棕榈油酸0.0092毫克/升、硬脂酸0.0085毫克/升、吐温802.4毫克/升、嵌段式聚醚F681599.8毫克/升；所述微量元素中各成分的终浓度分别为硫酸铜15.5毫克/升、硝酸铁84.2毫克/升、硫酸亚铁0.29毫克/升、亚硒酸钠131.2毫克/升。优选的，所述缓冲剂中各成分的终浓度分别为碳酸氢钠2680.0毫克/升、羟乙基哌嗪乙磺酸3毫克/升；所述酚红的终浓度为6.5毫克/升；所述蛋白水解物中各成分的终浓度分别为大豆水解物3600毫克/升、小麦水解物2400毫克/升；<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基，其特征在于，包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物、酸碱指示剂和其他添加组分，其中，/n所述氨基酸为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；/n所述维生素为生物素、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、硫胺素和硫辛酸；/n所述盐类为氯化镁、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和丙酮酸钠；/n所述脂类为胆固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温和嵌段式聚醚F68；/n所述微量元素为硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁和亚硒酸钠；/n所述缓冲剂为碳酸氢钠和羟乙基哌嗪乙磺酸；/n所述蛋白水解物为大豆水解物和小麦水解物；/n所述酸碱指示剂为酚红；/n所述其他添加组分为葡萄糖、次黄嘌呤和胸苷。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于培养DF-1细胞的无血清培养基，其特征在于，包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、缓冲剂、蛋白水解物、酸碱指示剂和其他添加组分，其中，
所述氨基酸为丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸；
所述维生素为生物素、叶酸、烟酰胺、吡哆醇、硫胺素和硫辛酸；
所述盐类为氯化镁、硫酸镁、氯化钙、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和丙酮酸钠；
所述脂类为胆固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、吐温和嵌段式聚醚F68；
所述微量元素为硫酸铜、硝酸铁、硫酸亚铁和亚硒酸钠；
所述缓冲剂为碳酸氢钠和羟乙基哌嗪乙磺酸；
所述蛋白水解物为大豆水解物和小麦水解物；
所述酸碱指示剂为酚红；
所述其他添加组分为葡萄糖、次黄嘌呤和胸苷。


2.根据权利要求1所述的用于培养DF-1细胞的无血清培养基，其特征在于，所述氨基酸中各成分的终浓度分别为丙氨酸4～8毫克/升、精氨酸100～200毫克/升、天冬酰胺6～20毫克/升、天冬氨酸9～16毫克/升、胱氨酸15～25毫克/升、半胱氨酸20～35毫克/升、谷氨酸7～15毫克/升、谷氨酰胺200～800毫克/升、甘氨酸10～25毫克/升、组氨酸20～50毫克/升、异亮氨酸30～60毫克/升、亮氨酸50～70毫克/升、赖氨酸100～150毫克/升、甲硫氨酸15～30毫克/升、苯丙氨酸30～50毫克/升、脯氨酸15～30毫克/升、丝氨酸20～40毫克/升、苏氨酸30～60毫克/升、色氨酸15～30毫克/升、酪氨酸40～70毫克/升、缬氨酸40～70毫克/升；
所述维生素中各成分的终浓度分别为生物素0.003～0.01毫克/升、叶酸2～5毫克/升、烟酰胺5～10毫克/升、吡哆醇2～5毫克/升、硫胺素2～5毫克/升、硫辛酸0.2～0.5毫克/升；
所述盐类中各成分的终浓度分别为氯化镁30～100毫克/升、硫酸镁30～100毫克/升、氯化钙150～200毫克/升、氯化钾300～500毫克/升、氯化钠1000～6000毫克/升、磷酸氢二钠50～100毫克/升、磷酸二氢钠50～100毫克/升、丙酮酸钠60～150毫克/升；
所述脂类中各成分的终浓度分别为胆固醇2～5毫克/升、生育酚醋酸酯0.005～0.01毫克/升、豆蔻酸0.005～0.01毫克/升、棕榈酸0.005～0.01毫克/升、棕榈油酸0.005～0.01毫克/升、硬脂酸0.005～0.01毫克/升、吐温801～3.0毫克/升、嵌段式聚醚F6810～2000毫克/升；
所述微量元素中各成分的终浓度分别为硫酸铜10～20毫克/升、硝酸铁50～100毫克/升、硫酸亚铁0.1～0.6毫克/升、亚硒酸钠80～150毫克/升；
所述缓冲剂中各成分的终浓度分别为碳酸氢钠1000～3700毫克/升、羟乙基哌嗪乙磺酸1000～5000毫克/升；
所述酚红的终浓度为5～10毫克/升；
所述蛋白水解物中各成分的终浓度分别为大豆水解物2000～4000毫克/升、小麦水解物2000～4000毫克/升；
所述其他添加组分中各成分的终浓度分别为葡萄糖2000～6000毫克/升、次黄嘌呤5～10毫克/升、胸苷0.1～0.8毫克/升。


3.根据权利要求2所述的用于培养DF-1细胞的无血清培养基，其特征在于，所述氨基酸中各成分的终浓度分别为丙氨酸5.2毫克/升、精氨酸168.1毫克/升、天冬酰胺7.92毫克/升、天冬氨酸9.34毫克/升、胱氨酸20.0毫克/升、半胱氨酸31.1毫克/升、谷氨酸12.5毫克/升、谷氨酰胺699.5毫克/升、甘氨酸19毫克/升、组氨酸36.9毫克/升、异亮氨酸53.7毫克/升、亮氨酸61.5毫克/升、赖氨酸134.4毫克/升、甲硫氨酸23.6毫克/升、苯丙氨酸40.2毫克/升、脯氨酸28.8毫克/升、丝氨酸28.0毫克/升、苏氨酸43.3毫克/升、色氨酸25.5毫克/升、酪氨酸51.7毫克/升、缬氨酸60.1毫克/升；
所述维生素中各成分的终浓度分别为生物素0.0039毫克/升、叶酸2.95毫克/升、烟酰胺7.98毫克/升、吡哆醇3.33毫克/升、硫胺素4.08毫克/升、硫辛酸0.37毫克/升；
所述盐类中各成分的终浓度分别为氯化镁70.4毫克/升、硫酸镁57.9毫克/升、氯化钙158.9毫克/升、氯化钾423.0毫克/升、氯化钠4908.7毫克/升、磷酸氢二钠69.21毫克/升、磷酸二氢钠90.75毫克/升、丙酮酸钠129.9...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洪林，刘志亮，孙友君，范娜娜，宋桂才，张恒，卢博，王稼林，马广斌，鹿洪伟，王月华，邹海涛，
申请(专利权)人：山东信得动物疫苗有限公司，山东诸子生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37