一种胃肠道间质瘤耐药细胞模型及其构建方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种胃肠道间质瘤耐药细胞模型及其构建方法和应用。本发明专利技术通过间歇浓度梯度倍增法针对胃肠道间质瘤细胞株GIST882进行体外诱导，建立了对于舒尼替尼IC50为127.5±2.15μmol/L，耐药指数为5.30的耐药细胞系，所述细胞系在细胞形态、超微结构、细胞周期均发生了变化，Kit基因测序显示存在17外显子R804L突变，INPP4B基因测序显示存在18外显子V466I突变，除此之外IRS2、SOX9、FLCN、WISP3、SOX10、MYCN也存在突变差异。本发明专利技术为进一步研究舒尼替尼的耐药机制和筛选胃肠间质瘤治疗新药物奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种胃肠道间质瘤耐药细胞模型及其构建方法和应用
本专利技术涉及细胞模型
，具体地说，涉及一种胃肠道间质瘤耐药细胞模型及其构建方法和应用。
技术介绍
胃肠间质瘤(GastrointestinalStromalTumors,GIST)作为一种常见的叶源性肿瘤，对放化疗均不敏感，舒尼替尼(Sunitinib)是晚期胃肠间质瘤治疗的主要靶向治疗药物。Sunitinib属于多靶点抑制剂，能够有效抑制KIT、VEGFR、PDGFRa、FLT3以及RET原癌基因编码的受体。而伴随Sunitinib临床使用当中的耐药问题日渐明显，这就需要针对具体耐药机制做出深入研究分析。对于耐药的患者进行二次取材比较困难，并且组织量很难满足我们实验所需，因此可考虑应用耐药细胞株进行舒尼替尼耐药机制的研究。国内外已有胃肠道间质瘤亲本细胞株和耐伊马替尼耐药细胞株建系的报道。如专利文献CN105062975A公开了一种Imatinib耐药的胃肠道间质瘤细胞系，专利文献CN105349493A公开了一种BRAF继发突变的甲磺酸伊马替尼耐药胃肠道间质瘤细胞系。另外也有格列卫耐药细胞系的报道，如专利文献CN103333858A公开了一种Gleevec耐药的胃肠道间质瘤细胞系。但目前未见舒尼替尼耐药细胞株的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种胃肠道间质瘤耐药细胞模型及其构建方法和应用。第一方面，本专利技术提供了一种胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系，所述胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系保藏号为CCTCCNO:C2020190。作为一个优选例，所述胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系其Kit基因存在17外显子R804L突变，INPP4B基因存在18外显子V466I突变，IRS2存在1外显子A942P突变、SOX9存在3外显子T239P突变、FLCN存在11外显子H429P突变、WISP3存在3外显子V138L突变、SOX10存在4外显子T240P突变、MYCN存在3外显子R322L突变。第二方面，本专利技术提供了如上所述的胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系的用途，所述用途选自下列任一种：a)研究胃肠道间质瘤获得性耐药的机制；b)寻找胃肠道间质瘤耐药逆转的靶点；c)筛选治疗胃肠道间质瘤的药物；d)构建舒尼替尼耐药的胃肠道间质瘤动物模型；d)研究分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性。第三方面，本专利技术提供了一种胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系的构建方法，即，以胃肠道间质瘤细胞株GIST882为原始细胞系，令所述胃肠道间质瘤细胞株GIST882产生以下突变：Kit基因存在17外显子R804L突变，INPP4B基因存在18外显子V466I突变，IRS2存在1外显子A942P突变、SOX9存在3外显子T239P突变、FLCN存在11外显子H429P突变、WISP3存在3外显子V138L突变、SOX10存在4外显子T240P突变、MYCN存在3外显子R322L突变。作为一个优选例，通过间歇浓度梯度倍增法针对所述胃肠道间质瘤细胞株GIST882进行体外诱导，使其对舒尼替尼耐药。更优选地，初次加入的舒尼替尼浓度为1/2IC50浓度。更优选地，终末次加入的舒尼替尼浓度为22μmol/L。更优选地，在获得能在终末次加入舒尼替尼的培养基中稳定生长并传代的细胞后，还包括对所述细胞进行基因测序的步骤。本专利技术优点在于：关于本研究，目的：构建胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs。方法：通过间歇浓度梯度倍增法针对胃肠道间质瘤细胞株GIST882进行体外诱导，使其对Sunitinib靶向药物耐药，研究构建的胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs。使用显微镜针对细胞形态进行观察；通过流式细胞仪针对细胞周期变动做出检测；CCK8法计算细胞半数致死浓度(IC50)及耐药指数。观察胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs长期保存的稳定性。结果：(1)耐药细胞在细胞形态方面具有上皮样特征，核浆比增加；在高倍镜之下能够发现多核细胞以及胞质内部的颗粒样物质有所提升。(2)耐药前后细胞周期变化，耐药细胞G0/G1期细胞比例有所提升，而S期比例降低。(3)胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs与GIST882相对比而言，针对Sunitinib的IC50有所提升，从23.98±1.85μmol/L提升到127.5±2.15μmol/L，耐药指数为5.30(P<0.05)。(4)对GIST882和胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs进行基因测序，Kit基因测序显示存在17外显子R804L突变，INPP4B基因测序显示存在18外显子V466I突变，除此之外IRS2、SOX9、FLCN、WISP3、SOX10、MYCN也存在突变差异。结论：获取到胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs，其针对Sunitinib靶向治疗所具备的敏感性显著下调，长期保存能够维持耐药特性。目前GIST治疗领域的难点是基因继发突变导致的耐药问题。探索肿瘤细胞产生耐药的原因以及如何改善肿瘤细胞对化疗药物耐药仍是目前研究的热点。肿瘤细胞耐药的产生是一个复杂的过程，它的机制广泛牵涉到药物代谢学、病理学、生理学等多个学科，这就决定了肿瘤细胞对化疗药物产生耐药的机制是复杂的，因此体外建立化疗药物耐药细胞株仍然是研究肿瘤细胞耐药机制的重要方法。本专利技术首次构建了胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs，有望成为研究胃肠间质瘤耐药机制以及耐药逆转剂筛选的重要细胞模型，为探索胃肠间质瘤治疗的新药物、新方法开辟新的道路。附图说明附图1：GIST882和胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs细胞的耐药性曲线。*，P<0.05。附图2：GSIT882细胞的生长周期。附图3：胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs细胞的生长周期。具体实施方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例11.材料与方法1.1培养GIST882细胞：细胞株从ATCC/中科院/协和医院引进，并已进行了细胞STR鉴定。细胞培养基是含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基。把细胞放到37℃、5％CO2并且饱和湿度的培养箱里面进行培养。1.2耐药细胞株的诱导：采用浓度梯度递增法，建立胃肠道间质瘤Sunitinib耐药细胞株GIST882-Rs。取对数生长期之下的GIST882，加入含有舒尼替尼的DMEM培养液，从低浓度(1/2IC50浓度)连续作用24-48h后，敏感细胞开始凋亡，弃去培养液，用PBS缓冲液洗3遍，换新鲜培养液，耐药细胞在培养液(无药物)里面继续培养，直到进入对数期，逐渐提高舒尼替尼浓度，进行反复诱导，并及时换液传代，直到培养获得可于Sunitin本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系，其特征在于，所述胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系保藏号为CCTCC NO:C2020190。/n

【技术特征摘要】
1.一种胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系，其特征在于，所述胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系保藏号为CCTCCNO:C2020190。


2.根据权利要求1所述的胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系，其特征在于，所述胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系其Kit基因存在17外显子R804L突变，INPP4B基因存在18外显子V466I突变，IRS2存在1外显子A942P突变、SOX9存在3外显子T239P突变、FLCN存在11外显子H429P突变、WISP3存在3外显子V138L突变、SOX10存在4外显子T240P突变、MYCN存在3外显子R322L突变。


3.权利要求1或2所述的胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系的用途，其特征在于，所述的用途选自下列任一种：
a)研究胃肠道间质瘤获得性耐药的机制；
b)寻找胃肠道间质瘤耐药逆转的靶点；
c)筛选治疗胃肠道间质瘤的药物；
d)构建舒尼替尼耐药的胃肠道间质瘤动物模型；
d)研究分析体外、体内药物敏感性及耐药性的相关性。


4.一种胃肠道间质瘤舒尼替尼耐药细胞系的构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：王翠华，于学涛，王婷琦，赵胜伟，姚新明，战海峰，王伟，冯丽波，钱小峰，
申请(专利权)人：上海市普陀区利群医院，
类型：发明
国别省市：上海;31