一种第四代CAR-T细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种第四代CAR‑T细胞及其应用，所述第四代CAR‑T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、分泌型IL‑7和NFAT调控型CCL19；所述IL‑7的信号肽为IL‑10信号肽；所述CCL19的启动子为NFAT调控启动子。本发明专利技术通过将IL‑7的原有信号肽改变为T细胞分泌蛋白IL‑10的信号肽，并采用NFAT调控型启动子作为CCL19的启动子，使得CAR‑T细胞能够将IL‑7分泌到胞外，并条件性表达CCL19，不仅促进了CAR‑T细胞的增殖，而且最大程度招募免疫细胞到肿瘤内部，显著提高了CAR‑T的抗肿瘤功效。

【技术实现步骤摘要】
一种第四代CAR-T细胞及其应用
本专利技术属于生物医药
，涉及一种第四代CAR-T细胞及其应用。
技术介绍
嵌合抗原受体T细胞(ChimericantigenreceptorTcell，CAR-T)免疫治疗是通过在T细胞膜上表达特异性识别并结合肿瘤抗原的嵌合抗原受体分子，诱导T细胞活化，从而实现对肿瘤细胞特异性杀伤的一种技术。这项技术是目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一，在白血病治疗领域已取得了巨大突破。但是，在实体瘤的治疗上，此技术仍然存在诸多问题。科研人员正在努力试图对CAR-T疗法进行改进和优化，通过提高嵌合抗原受体的亲和力、敲除CAR-T细胞的PD-1等方法提高CAR-T对实体瘤的治疗效果。CN109153989A构建的CAR-T细胞可以持续分泌IL-7和CCL19，不仅提高了CAR-T细胞的体外扩增能力，而且招募到更多外周血循环T细胞和树突状细胞到肿瘤内，增强了CAR-T细胞的抗肿瘤效果。但是，当CAR-T细胞留存在脾脏、淋巴结等免疫细胞较多的地方时，分泌的CCL19会将外周血循环T细胞和树突状细胞招募到特定部位，减少血液循环中的T细胞和树突状细胞的比例，从而降低了T细胞和树突状细胞被招募到肿瘤内的几率。因此，构建一种新型CAR-T细胞，不仅能分泌IL-7和CCL19，而且能最大程度将外周血免疫细胞招募到肿瘤内部，在实体瘤的治疗领域具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种第四代CAR-T细胞及其应用，通过将IL-7的信号肽优化为T细胞分泌蛋白IL-10的信号肽，并将CCL19的持续性分泌优化为NFAT调控性分泌，显著提高了CAR-T细胞的抗肿瘤效果，并降低了炎症副反应发生几率。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种第四代CAR-T细胞，所述第四代CAR-T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、分泌型IL-7和NFAT调控型CCL19；所述IL-7的信号肽为IL-10信号肽；所述CCL19的启动子为NFAT调控启动子。本专利技术中，将IL-7信号肽替换为T细胞分泌蛋白IL-10的信号肽，使得CAR-T细胞将外源性IL-7分泌到胞外，IL-7增强了T细胞的体外增殖能力；采用NFAT调控启动子调控T细胞对CCL19的表达，当CAR-T细胞处于静息状态时，CCL19不表达，当CAR-T细胞识别肿瘤抗原被激活后，NFAT调控启动子3×NFAT-RE-IL-2启动对CCL19的转录和翻译，CCL19开始表达，实现了外周血免疫细胞最大程度被招募到肿瘤内部的效果。优选地，所述IL-10信号肽包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；SEQIDNO:1：MHSSALLCCLVLLTGVRA。优选地，所述IL-7包括SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；SEQIDNO:2：DCDIEGKDGKQYESVLMVSIDQLLDSMKEIGSNCLNNEFNFFKRHICDANKEGMFLFRAARKLRQFLKMNSTGDFDLHLLKVSEGTTILLNCTGQVKGRKPAALGEAQPTKSLEENKSLKEQKKLNDLCFLKRLLQEIKTCWNKILMGTKEH。优选地，所述CCL19包括SEQIDNO:3所示的氨基酸序列；SEQIDNO:3：MALLLALSLLVLWTSPAPTLSGTNDAEDCCLSVTQKPIPGYIVRNFHYLLIKDGCRVPAVVFTTLRGRQLCAPPDQPWVERIIQRLQRTSAKMKRRSS。优选地，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。优选地，所述信号肽包括GM-CSF信号肽。优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种，进一步优选为PSCA。优选地，所述抗原结合结构域为靶向PSCA的单链抗体。优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，优选为CD28跨膜结构域。优选地，所述信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28胞内结构域和CD3ζ的组合。优选地，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗PSCA单链抗体、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域和CD3ζ串联组成。优选地，所述嵌合抗原受体包括SEQIDNO:4所示的氨基酸序列；SEQIDNO:4：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVRFIHWYQQKPGKAPKRLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSSSPFTFGQGTKVEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDYYIHWVRQAPGKGLEWVAWIDPENGDTEFVPKFQGRATISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCKTGGFWGQGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。第二方面，本专利技术提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包括嵌合抗原受体编码基因、IL-10信号肽编码基因、IL-7编码基因、NFAT调控启动子和CCL19编码基因。优选地，所述嵌合抗原受体编码基因包括SEQIDNO:5所示的核酸序列；SEQIDNO:5：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctggacattcagctgacccaatctccaagctctttgtccgcctctgtgggggatagggtcaccatcacctgcagtgccagttcaagtgtaagattcattcactggtaccagcagaaaccaggaaaagctcccaaaagactcatctatgacacatccaaactggcttctggcgtcccttctaggttc本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种第四代CAR-T细胞，其特征在于，所述第四代CAR-T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、分泌型IL-7和NFAT调控型CCL19；/n所述IL-7的信号肽为IL-10信号肽；/n所述CCL19的启动子为NFAT调控启动子。/n

【技术特征摘要】
1.一种第四代CAR-T细胞，其特征在于，所述第四代CAR-T细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、分泌型IL-7和NFAT调控型CCL19；
所述IL-7的信号肽为IL-10信号肽；
所述CCL19的启动子为NFAT调控启动子。


2.根据权利要求1所述的第四代CAR-T细胞，其特征在于，所述IL-10信号肽包括SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述IL-7包括SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；
优选地，所述CCL19包括SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。


3.根据权利要求1或2所述的第四代CAR-T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域；
优选地，所述信号肽包括GM-CSF信号肽；
优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括CD19、CD20、CD22、CD30、CEA、EGFR、BRAF、HER-2、Mesothelin、MUC1、PSCA、GPC3、TERT、PTEN、PD-1、PD-L1或VEGF中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种，进一步优选为PSCA；
优选地，所述抗原结合结构域为靶向PSCA的单链抗体；
优选地，所述跨膜结构域包括CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域，优选为CD28跨膜结构域；
优选地，所述信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR2、4-1BB、TLR1、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD28胞内结构域和CD3ζ的组合。


4.根据权利要求1-3任一项所述的第四代CAR-T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗PSCA单链抗体、CD28跨膜结构域、CD28胞内结构域和CD3ζ串联组成；
优选地，所述嵌合抗原受体包括SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤朝阳，秦乐，吴迪，魏志辉，王翠花，王艳艳，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：广东昭泰体内生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44