无血清培养基及其在间充质干细胞传代培养中的应用制造技术

本发明专利技术涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及无血清培养基及其在间充质干细胞传代培养中的应用。本发明专利技术提供的添加剂适用于制备间充质干细胞多次传代及有效维持干性的无血清培养基，可有效改善间充质干细胞传代及扩增能力不足的缺点，为未来干细胞产品实现规模化、标准化、产业化提供稳定的基础材料。实验表明，采用本发明专利技术的添加剂不仅能够促进间充质干细胞的扩增和传代，还能很好的维持间充质干细胞表面标记物的表达，细胞干性得到有效维持。

【技术实现步骤摘要】
无血清培养基及其在间充质干细胞传代培养中的应用
本专利技术涉及干细胞培养
，尤其涉及无血清培养基及其在间充质干细胞传代培养中的应用。
技术介绍
干细胞及其代表的再生医学领域研究近二十年来不断取得重大技术突破，引发了人们对干细胞技术产业化及临床应用的高度重视。截止到2019年，全球已有16款干细胞产品上市，其中间充干细胞(Mesenchymalstemcells,MSCs)由于具有多种优点而成为产品最多，发展最为迅猛的干细胞类型。间充质干细胞来源于发育早期的中胚层，是一类非造血干细胞，其广泛存在于骨髓、皮下脂肪、骨外膜、肌肉、滑膜、滑液、肝脏、外周组织、脐带、脐带血及胎盘等组织。MSCs具有高度自我更新能力、多向分化潜能，可在体外培养扩增，不仅能够支持造血干细胞的生长，还具有免疫调控的作用；不同的诱导条件下，在体外可分化为骨、软骨、肌肉、神经、心肌、内皮和脂肪等，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。因此，MSCs具有广阔的临床应用前景，是细胞替代治疗和组织工程的首选种子细胞，是移植领域和自身性免疫疾病治疗的研究热点。在生物医学工程领域的研究中，大量种子细胞的获取往往需要通过干细胞的体外培养和收获来实现。目前间充质干细胞培养使用有血清培养基或无血清培养基。有血清培养基大都含有动物血清，如最为常见的胎牛血清(fetalbovineserum,FBS)。FBS成分复杂且含有异种蛋白质，容易携带病毒或被支原体感染等。另一方面，FBS批间差异较大，来源不稳定，对体外大规模扩增MSCs工艺影响较大。无血清培养基(Serum-FreeMedium，SFM)，顾名思义是指在细胞培养中不需要添加动物或人源血清。但为了满足细胞生长的要求，通常会向培养基中添加替代血清功能的原料，主要包括结合蛋白、生长因子、粘附因子、激素、微量元素等加大类别。但目前阶段间充质干细胞的无血清培养基产品均具有细胞传代及扩增能力不足的缺点，难于满足目前行业内对规模化、标准化、产业化的，可临床应用的间充质干细胞相关技术与产品的需求，这也是目前SFM研发企业急需突破的瓶颈。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供无血清培养基及其在间充质干细胞传代培养中的应用，该无血清培养基中的添加剂组成合理，能够有效改善间充质干细胞传代及扩增能力不足的缺点。本专利技术提供了一种添加剂，其包括：MEMNon-EssentialAminoAcidsSolution、MEMVitaminSolution、Chemicallydefinedlipidconcentrate、Traceelementssolution、L-谷氨酰胺、L-谷胱甘肽、L-抗坏血酸、氢化可的松、雌二醇、孕酮、人血白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、bFGF、EGF、PDGF-BB、Wnt-3a、TGF-β1、纤连蛋白、乙醇胺、腺嘌呤、亚硒酸钠和β-巯基乙醇。本专利技术提供的添加剂中各种组分的存储浓度为工作浓度的1～100倍，各组分工作浓度为：本专利技术还提供了一种无血清培养基，其包括基础培养基和如下浓度的组分：一些实施例中，所述培养基包括基础培养基和如下浓度的组分：一些实施例中，所述培养基包括基础培养基和如下浓度的组分：一些实施例中，所述培养基包括基础培养基和如下浓度的组分：本专利技术提供的无血清培养基中，所述基础培养基为DMEM/F12、IMDM或a-MEM。所述无血清培养基中还包括青霉素和链霉素。本专利技术所述的培养基在干细胞培养中的应用。所述干细胞为脐带间充质干细胞。所述干细胞培养为干细胞的扩增培养或传代培养。本专利技术还提供了一种干细胞的培养方法，其将干细胞接种至所述的培养基进行培养。本专利技术中，所述培养的容器为六孔板，所述接种的密度为1×105cells/孔，每3～4天传代。本专利技术提供了一种添加剂，该添加剂适用于制备间充质干细胞多次传代及有效维持干性的无血清培养基，可有效改善间充质干细胞传代及扩增能力不足的缺点，为未来干细胞产品实现规模化、标准化、产业化提供稳定的基础材料。实验表明，采用本专利技术的添加剂不仅能够促进间充质干细胞的扩增和传代，还能很好的维持间充质干细胞表面标记物的表达，细胞干性得到有效维持。附图说明图1各组UC-MSCs各个代次形态图(100×)；图2各组UC-MSCs各个代次扩增倍数；图3各组UC-MSCs成脂分化效果图(400×)；图4各组UC-MSCs成骨分化效果图(100×)。具体实施方式本专利技术提供了核酸序列及其作为启动子的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。本专利技术采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。本专利技术中，所涉及的组分、试剂均为常规市售产品。如DMEM/F12基础培养基(货号11330)、MEMNon-EssentialAminoAcidsSolution(货号11140-050)MEMVitaminSolution(货号11120052)购自Gibco公司。其他组分均可从sigma、Gibco、corning等公司购得。乙醇胺(货号E0135)购自sigma公司；Chemicallydefinedlipidconcentrate(货号11905031)购自Gibco公司；Traceelementssolution(货号25-023)购自corning公司。下面结合实施例，进一步阐述本专利技术：实施例1所述无血清培养基成分包括：表1各组无血清培养基成分各组分按其各自溶解特性溶解，0.22m滤膜过滤除菌，加入到基础培养基中混匀，然后加入青霉素链霉素，至浓度为1vol％。实施例2以实施例1的无血清培养基设为实验组，含10％FBS的完全培养基设为对照组1，BI公司的MesenCult-XFMedium为对照组2，开展以下实验。1、UC-MSCs连续传代的形态观察及活性检测选择P3代UC-MSCs开展实验，每隔3-4天传代，UC-MSCs均按1×105/孔的细胞量接种于六孔板中，每组设置3个重复。置于5％CO2培养箱37℃培养。每次传代前采集UC-MSCs图像，细胞形态图(100×)如图1所示。表2各组UC-MSCs各个代次活性检测细胞计数结果注，**示与对照组1相比存在极显著性差异，p<0.01；ΔΔ示与对照组2相比存在极显著性差异，p<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种添加剂，其包括：MEM Non-Essential Amino Acids Solution、MEM VitaminSolution、Chemically defined lipid concentrate、Trace elements solution、L-谷氨酰胺、L-谷胱甘肽、L-抗坏血酸、氢化可的松、雌二醇、孕酮、人血白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、bFGF、EGF、PDGF-BB、Wnt-3a、TGF-β1、纤连蛋白、乙醇胺、腺嘌呤、亚硒酸钠和β-巯基乙醇。/n

【技术特征摘要】
1.一种添加剂，其包括：MEMNon-EssentialAminoAcidsSolution、MEMVitaminSolution、Chemicallydefinedlipidconcentrate、Traceelementssolution、L-谷氨酰胺、L-谷胱甘肽、L-抗坏血酸、氢化可的松、雌二醇、孕酮、人血白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、bFGF、EGF、PDGF-BB、Wnt-3a、TGF-β1、纤连蛋白、乙醇胺、腺嘌呤、亚硒酸钠和β-巯基乙醇。


2.根据权利要求1所述的添加剂，其特征在于，其各种组分的存储浓度为工作浓度的1～100倍，各组分工作浓度为：








3.一种无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和如下浓度的组分：



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【专利技术属性】
技术研发人员：陈东煌，陈海佳，王小燕，姜交华，戚康艺，
申请(专利权)人：生物岛实验室，广东国科细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44