一种新型冠状病毒表面蛋白受体结合区制备方法技术

本发明专利技术公开了一种新型冠状病毒表面蛋白受体结合区制备方法。本发明专利技术提供了SEQ ID No.1所示多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：提高SARS‑CoV‑2表面蛋白受体结合区在宿主细胞中的分泌表达产量、分泌表达效率；制备SARS‑CoV‑2表面蛋白受体结合区分泌蛋白制品；所述相关生物材料为SEQ ID No.1所示多肽的编码基因或含有编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。本发明专利技术采用新冠病毒S蛋白的天然信号肽和SEQ ID No.1所示人工信号肽，用于引导新冠病毒RBD真核细胞分泌表达，结果显示人工信号肽分泌表达水平显著优于天然信号肽，更适用于大规模工业化生产，降低生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒表面蛋白受体结合区制备方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种新型冠状病毒表面蛋白受体结合区制备方法。
技术介绍
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)属于冠状病毒的β属。新型冠状病毒是一种包膜的正链RNA病毒，基因组大小29903nt，主要有表面蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)四种结构蛋白。其中，表面蛋白(S)主要功能以及研究意义如下：1)承担病毒与宿主细胞膜受体(ACE-2)结合及膜融合功能；2)决定病毒的宿主范围和特异性；3)通过受体结合区(RBD)的基因重组或突变可以实现不同宿主间传播，并导致较高致死率；4)宿主中和抗体的重要作用位点；5)疫苗设计的关键靶点。目前，表面蛋白(S)的受体结合区(RBD)被认为是诱导机体产生中和抗体的最主要的抗原靶区域，能够将机体刺激产生的中和抗体更加聚焦在针对病毒的受体结合，可以提高疫苗的免疫原性和免疫效率。SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区作为关键免疫原，采用真核细胞分泌表达具有显著优势：1)分泌表达上清蛋白背景低，纯化工艺简单；2)可溶性表达，避免形成包涵体；3)信号肽酶精准切割，N端无冗余Met残基，产生符合预期的蛋白序列。分泌表达通常需要在目标蛋白N端融合信号肽序列，引导外源蛋白定位分泌到特定膜系统。信号肽位于分泌蛋白的N端，一般由15-30个氨基酸组成，包括三个区：1)带正电的N末端，称为碱性氨基末端；2)中间疏水序列，以中性氨基酸为主，能够形成α螺旋结构，也是信号肽的主要功能区；3)带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点，也称加工区。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型冠状病毒表面蛋白受体结合区制备方法。本专利技术发现一种人工合成信号肽(信号肽H，SEQIDNo.1)，引导SARS-CoV-2的S表面蛋白受体结合区(RBD)分泌至培养上清，经过镍柱纯化即可获得高纯度抗原，且其分泌表达产量显著高于S蛋白天然信号肽(信号肽S)。第一方面，本专利技术要求保护SEQIDNo.1所示多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用。SEQIDNo.1所示多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：P1、提高SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区在宿主细胞中的分泌表达产量；P2、提高SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区在宿主细胞中的分泌表达效率；P3、制备SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区分泌蛋白制品。所述相关生物材料为SEQIDNo.1所示多肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。其中，所述宿主细胞为真核宿主细胞。进一步地，所述真核宿主细胞可为HEK293细胞，CHO细胞，酵母细胞和昆虫细胞等。在本专利技术的具体实施方式中，所述宿主细胞具体为Expi293F细胞。其中，所述编码基因可为如下任一：(a1)SEQIDNo.2所示的DNA分子；(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码SEQIDNo.1所示多肽的DNA分子；(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQIDNo.1所示多肽的DNA分子。在本专利技术的具体实施方式中，所述重组载体为将SEQIDNo.5所示DNA片段(SEQIDNo.5的第1-57位为信号肽H的编码基因，即SEQIDNo.2)插入到pCGS3载体的多克隆位点(如HindIII和PacI)后得到的重组质粒。第二方面，本专利技术要求保护一种融合蛋白。本专利技术所要求保护的融合蛋白，为将SEQIDNo.1所示多肽融合于SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区的N端后所得。进一步地，所述SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区的氨基酸序列如SEQIDNo.4的第20-242位所示。更进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.4的第1-242位或第1-247位所示或如SEQIDNo.4所示。SEQIDNo.4的第1-19位为信号肽H(即SEQIDNo.1)，第20-242位为所述SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区，第243-247位为Linker接头，第248-253位为组氨酸标签。第三方面，本专利技术要求保护编码第二方面中所述融合蛋白的核酸分子。进一步地，所述核酸分子自5’端到3’端依次包括SEQIDNo.1所示多肽的编码基因和SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区的编码基因。更进一步地，所述SEQIDNo.1所示多肽的编码基因可为如下任一：(a1)SEQIDNo.2所示的DNA分子；(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码SEQIDNo.1所示多肽的DNA分子；(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQIDNo.1所示多肽的DNA分子。更进一步地，所述SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区的编码基因可为如下任一：(b1)SEQIDNo.3所示的DNA分子；(b2)在严格条件下与(b1)限定的DNA分子杂交且相同蛋白质的DNA分子；(b3)与(b1)或(b2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码相同蛋白质的DNA分子。更加具体地，所述核酸分子为SEQIDNo.5的第1-726位或第1-741位所示DNA分子或SEQIDNo.5所示DNA分子。SEQIDNo.5的第1-57位为所述SEQIDNo.1所示多肽的编码基因(即SEQIDNo.2)，第58-726位为所述SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区的编码基因(即SEQIDNo.3)，第727-741位为Linker接头的编码基因，第742-759位为组氨酸标签的编码基因。上述核酸分子或编码基因中，同一性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gapexistencecost，Perresiduegapcost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)，检索一对核苷酸序列的同一性，进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。上述核酸分子或编码基因中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。上述核酸分子或编码基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNa3PO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mMED本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.SEQ ID No.1所示多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：/nP1、提高SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区在宿主细胞中的分泌表达产量；/nP2、提高SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区在宿主细胞中的分泌表达效率；/nP3、制备SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区分泌蛋白制品；/n所述相关生物材料为SEQ ID No.1所示多肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。/n

【技术特征摘要】
20201014 CN 20201109557391.SEQIDNo.1所示多肽或其相关生物材料在如下任一中的应用：
P1、提高SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区在宿主细胞中的分泌表达产量；
P2、提高SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区在宿主细胞中的分泌表达效率；
P3、制备SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区分泌蛋白制品；
所述相关生物材料为SEQIDNo.1所示多肽的编码基因或含有所述编码基因的表达盒或重组载体或重组菌或转基因细胞系。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述宿主细胞为真核宿主细胞。


3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述编码基因为如下任一：
(a1)SEQIDNo.2所示的DNA分子；
(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码SEQIDNo.1所示多肽的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQIDNo.1所示多肽的DNA分子。


4.融合蛋白，为将SEQIDNo.1所示多肽融合于SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区的N端后所得；
进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.4的第1-242位或第1-247位所示或如SEQIDNo.4所示。


5.编码权利要求4所述融合蛋白的核酸分子。


6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子自5’端到3’端依次由SEQIDNo.1所示多肽的编码基因和SARS-CoV-2表面蛋白受体结合区的编码基因组成；
进一步地，所述SEQIDNo.1所示多肽的编码基因为如下任一：
(a1)SEQIDNo.2所示的DNA分子；
(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA分子杂交且编码SEQIDNo.1所示多肽的DNA分子；
(a3)与(a1)或(a2)限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQIDNo.1所示多肽的D...

【专利技术属性】
技术研发人员：张静静，安文琪，王斌，邢体坤，宋路萍，毕利利，
申请(专利权)人：华兰基因工程有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41